实验一 显微镜使用与细菌的革兰氏染色及其形态观察.pptVIP

一、实验目的 1、掌握油镜的原理和使用方法， 2、掌握涂片无菌操作技术； 3、掌握革兰氏染色技术； 4、学会观察球菌、杆菌、芽孢杆菌的细胞形态。 实验一 显微镜的使用与细菌的革兰氏染色及其形态观察 二、实验原理 1、普通光学显微镜的构造与油镜的工作原理 显微镜的构造：分机械装置和光学系统。 物镜转换器（三种物镜：低倍镜4×或10×，高倍镜40×，油镜100×）、 推进器、 粗微调旋钮。 调节光线的三个部分：光源亮度、光圈、聚光器的升降螺旋。 实验一 显微镜的使用与细菌的革兰氏染色及其形态观察 显微镜的构造：分机械装置和光学系统（三个可以调节光线旋钮） 1.物镜转换器； 9.电源开关 2.物镜； 10.光源滑动变阻器 3.游标卡尺 11.粗调螺旋； 4.载物台； 12.微调螺旋； 5.聚光器； 13.镜臂； 6.虹彩光圈； 14.镜筒； 7.光源； 15.目镜； 8.镜座； 16.标本移动螺旋 二、实验原理 2、油镜的工作原理： (1)增加照明亮度 在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类，如香柏油(n=1.52)等，则光线不发生折射，增加了视野的照明亮度。 (2)增加显微镜的分辨力 分辨力指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。 分辨力(最大可分辨距离)=λ/2NA 以空气为介质时，NA=1×0.87=0.87； 而以香柏油为介质时，NA=1.52×0.87=1.32，故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜分辩力高，因而细菌用油镜才可观察到。 二、实验原理 3、革兰氏染色原理 由于细菌细胞壁的结构和化学组成不同，经染色后，呈现不同的染色反应，将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 染色关键在于乙醇脱色作用。 对于G+菌：乙醇脱色时因细胞壁的脱水作用，通透性降低，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱，复染后细胞仍保留初染剂的蓝紫色。 对于G-菌：乙醇脱色时因细胞壁的脱脂作用，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘的复合物易被洗脱，复染后细胞被染上复染剂的红色。 二、实验原理 4、涂片无菌操作过程 1—灼烧接种环 2—拔去棉塞 3—烘烤试管口 4—挑取少量菌体 5—再烘烤试管口 6—将棉塞塞好 7—做涂片 8—烧去残留菌体 1、仪器 显微镜， 2、菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)； 3、用品 细菌形态标本片，擦镜纸1套，二甲苯1瓶，香柏油一瓶； 接种针、试管架，盖玻片、载玻片、10ml无菌生理盐水。 革兰氏染液包括：结晶紫、番红、碘液、95%乙醇、吸水纸、火柴、酒精灯、废液缸、洗瓶，酒精缸（放干净的载玻片）。 三、实验用具和材料 四、实验内容 1、低倍镜、高倍镜、油镜的使用方法。 准备材料： 显微镜2台，细菌形态标本片3个，擦镜纸1套，二甲苯1瓶，香柏油一瓶（一组用品） 实验步骤： （1）低倍镜 旋动粗调螺旋→使物镜与标本片距离约0.5cm→缓慢调节使物像清晰。 （2）高倍镜 低倍镜直接转换高倍镜→调节亮度至适宜→微调细螺旋使物像清晰。 （3）油镜 低倍镜找到样品观察区，亮度调到最强→滴加香柏油→转换油镜头调出物像。 处理镜头：擦镜纸——二甲苯——擦镜纸 收镜：物镜呈八字形，载物台调到最低。 四、实验内容 2、细菌染色玻片标本的油镜观察 准备材料： 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等染色玻片标本； 实验步骤： 按照低倍镜——高倍镜——油镜的使用方法进行观察并绘图。 要求：标出菌种名称，放大倍数，一个视野画3-5个菌，染色部分用铅笔化成实心的。 四、实验内容 菌种： 每组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌各1支（生长活跃期的幼龄培养物）。 用具：接种针2套、试管架1个，盖玻片一盒、载玻片10片、10mL无菌生理盐水3只。 实验步骤： （1）灼烧接种环 （2）拔去棉塞（3）烘烤试管口（4）挑取少量菌体（5）再烘烤试管口（6）将棉塞塞好 （7）做涂片（8）烧去残留菌体。 3、涂片无菌操作技术 四、实验内容 准备材料： 革兰氏染液1套包括：结晶紫、番红、碘液、95%乙醇、香柏油、二甲苯、吸水纸、擦镜纸、火柴、酒精灯、废液缸、洗瓶，酒精缸（放干净的载玻片）。 示范教学：示范下面的染色步骤。 实验步骤： 上述涂片→干燥→固定（以钟摆的速度通过火焰3-