三亲结合GFP转化.docxVIP

GFP 转化试验 以 Smo3 为例，转化GTetr 质粒： 受体菌Sm03 菌株抗性鉴定为抗Amp(氨苄青霉素)。 助细胞PRK2013 是携带 2013 基因和Km(卡那霉素)抗性质粒的杆菌。 供体菌GTetr 是携带GFP 基因和Gm(庆大霉素)抗性标记质粒的大肠杆菌。供体菌KTetr 是携带GFP 基因和Km(卡那霉素)抗性标记质粒的大肠杆菌。供体菌ATetr是携带GFP 基因和Amp(氨苄青霉素)抗性标记质粒的大肠杆菌。供体菌PHC60 是携带GFP 基因和Tc(四环素)抗性标记质粒的大肠杆菌。 以下步骤均在超净工作台上进行： 接种 Smo3，PRK2013，供体菌于10mL 含有相应抗生素(Amp，Km，Gm)的 LB 液体培养基中，于 37℃下遥床 200 rpm 过夜培养。 分别取 300μL 供体菌菌液，600μL 助细胞菌液和600μL 受体菌菌液于 1.5mL 离心管中， 7000rmp 离分 10min 收集菌体。 倒掉上清，用无菌水洗涤重悬一次菌体，同上条件离心10min 收集菌体。 重复步骤 3 一次。 用 500μL 无菌水重悬菌体，吸取 100μL 菌悬液于 10mL 无抗生素LB 液体培养基中。37℃ 下遥床 200rmp 培养 24-36 小时。 准备双抗平板，微波炉中溶化预先准备好的固体培养基，冷却到不烫手的温度，向100mL 固体培养基中