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(完整)酵母单杂交实验步骤总结,推荐文档--第1页 1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi ）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到pAbAi 载体AbAir 报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 目的DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 长度小于20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2 ） 用TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度100 mol/L 。 （3 ） 将正向链和反向链按照1:1 的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度 为50 mol/L ）。 （4 ） 95 C 保温30 s，去除二级结构。 （5 ） 72 C 保温2 min ，37 C 保温2 min ，25 C 保温2min 。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6 ） 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C 冰箱备用。 （7 ） 酶切1 L pAbAi 载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8 ） 将退火后的寡核苷酸稀释100 倍至终浓度为0.5 mol/L 。 （9 ） 在连接反应管中加入如下成分： pAbAi 载体（50 ng/L ） 1.0 L annealed oligonucleotide （0.5 mol/L ） 1.0 L 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 L BSA （10 mg/mL） 0.5 L Nuclease-free H O 10.5 L 2 T4 DNA ligase （400 U/L ） 0.5 L 总体积 15 L 注：如果有必要，可用1 L nuclease-free H O 代替寡核苷酸作为阴性对 2 照。 （10） 将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli ，采用常规方法检测阳性克隆。 (完整)酵母单杂交实验步骤总结,推荐文档--第1页 (完整)酵母单杂交实验步骤总结,推荐文档--第2页 注：可用酶切或测序进行检测。 2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter 酵母菌株（图） 图3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意图 （1） 用BstB I 或者Bbs I 酶切2 L pBait-AbAi，pMutant-AbAi ，p53-AbAi 质粒， 使其在URA3 基因处断开，纯化酶切产物。 （2 ） 按Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用1 l 酶切后的质粒 转化Y1HGol 酵母。 （3 ） 稀释每个转化体系至 1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于 SD/-