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第九章 分子杂交技术 第1页，共40页。 主 要 内 容 核酸杂交的基本理论 核酸探针 核酸分子杂交方法 蛋白质分子杂交 第2页，共40页。 第一节 核酸杂交的基本理论—DNA的变性与复性 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) ——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 第3页，共40页。 核酸分子杂交的原理 第4页，共40页。 第5页，共40页。 第二节 核酸探针 探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异性结合的核酸分子 DNA/RNA探针 主要内容 探针的分类 探针的标记 标记物 第6页，共40页。 一、探针的分类 DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 根据核酸探针的来源及性质可分为： 第7页，共40页。 ①这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。 ②DNA探针不易降解（相对RNA而言） ③DNA探针的标记方法较成熟 cDNA探针 用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点： 第8页，共40页。 RNA探针的主要优点有 ①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因而杂交的特异性更高。 ②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。 ③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。 ④杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。 第9页，共40页。 ①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。 ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。 ③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。 寡核苷酸探针 第10页，共40页。 切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法 T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上 二、探针的标记 第11页，共40页。 切口平移法 该技术由Kelly等于1970年创立。 其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些切口（nick ）,切口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。 其结果是在切口平移。 用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。 第12页，共40页。 第13页，共40页。 随机引物延伸（random primer) 这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法。 原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物（random primer）。 这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。 第14页，共40页。 第15页，共40页。 聚合酶链反应　 PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性DNA探针。 PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内大量合成探针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达70%～80%。 因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。 该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。 使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。 第16页，共40页。 第17页，共40页。 T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激