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慢病毒载体构建步骤研究--第1页 一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是 HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基 因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可 将外源基因有效地整合到 宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效 果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是 短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然 后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因 表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥 长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期 性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型 的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组 织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病 毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病 毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这 是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成 1~4 个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自 身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。 在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两 条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4～5T 转录终止位点之间的茎环结构序列， 转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。 构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体 要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可 提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度 慢病毒载体构建步骤研究--第1页 慢病毒载体构建步骤研究--第2页 的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得 上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录， 整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA 的重组载 体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T