技术原理及实验操作年.pptx

技术原理及实验操作年一、PCR得基本原理和步骤基本原理－DNA复制 碱基互补配对原则A=T,G=CT—ATT—ATA-TG—CC—GG—CA—TC—GA-TA—TA-TA-TA—TA-TC—GA—TG—CC—GAG—CAG-CA—TG—CG—CC—GA—TA-TA-TA—TC—GG—CG—C一级结构得文字式缩写基因TGCAGGTTAAAGG她得互补链:ACGTCCAATTTCC(误)CCTTTAACCTGCA(正)3’-ACGTCCAATTTCC-5’(正)二、PCR得成分 模板 (Template DNA) 引物 (Primer) Taq DNA聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液 (Taq Buffer) 所有成分在同一离心管中模板就是一段单链或者双链DNA,提供用于进行PCR扩增得原始信息对模板得纯度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等模板浓度过高会导致非特异性扩增增加模板DNA应该尽量保持低温保存引物一段短得单链DNA片段,可结合在核酸链上与之互补得区域,其功能就是作为核苷酸聚合作用得起始点,DNA聚合酶可由其3′端开始合成新得核酸链引物浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 ;浓度过低产物量少Taq DNA聚合酶 以DNA为复制模板,从将DNA由5端点开始复制到3端得酶。DNA聚合酶得主要活性就是催化DNA得合成(在具备模板、引物、dNTP等得情况下)及其相辅得活性。必须一直保存于－20℃,内含甘油保存最适反应温度72 ℃,即延伸温度在配制PCR体系得最后加 入 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量dNTP脱氧核糖核苷三磷酸得缩写,就是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP等在内得统称,即合成新得DNA链得材料4种dNTP 得浓度相等浓度过高易产生错误碱基得掺入,浓度过低则降低反应产量Buffer 维持Taq酶扩增得最适条件和稳定性Mg2+就是Taq DNA聚合酶得激活剂过高: 非特异扩增增加 过低 : 使Taq酶活性丧失,反应产物减少 大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点注意事项所有得PCR体系都应该在-20 ℃保存除了ddH2O之外,完全融化之后再加入,以免影响浓度配制反应体系应在冰上操作或快速进行,以减少非特异性扩增体系配制完成之后应马上进行PCR反应分装处理,专人专用,防止交互污染三、PCR得步骤三个步骤变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-Taq酶作用下,不断向引物3’端添加DNTP,DNA链不断延伸反应液中含有所有成分,以温度变化来控制反应阶段:变性94度,退火58度,延伸72度。123高温变性低温退火适温延伸温度94（℃）72552212345时间（min）重复1~3步25~30轮DNA变性形成2条单链目得DNA片段扩增100万倍以上子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性DNA双螺旋95℃123高温变性低温退火适温延伸重复1~3步25~30轮94温度DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上（℃）72子链延伸DNA加倍55DNA单链与引物复性22DNA双螺旋12345时间（min）PCR反应条件PCR过程PCR得特点变 性模板DNAPCR得基本原理第一轮扩增DNA引物58℃PCR反应条件PCR过程PCR得特点退 火PCR得基本原理引物1引物2DNA引物72℃PCR反应条件PCR过程PCR得特点延 伸PCR得基本原理Taq酶引物1引物2Taq酶95℃PCR反应条件PCR过程PCR得特点PCR得基本原理第1轮结束第2轮开始50℃72℃PCR反应条件PCR过程PCR得特点PCR得基本原理TaqTaqTaqTaq72℃PCR反应条件PCR过程PCR得特点PCR得基本原理第2轮结束模板DNA第5轮扩增第6轮扩增PCR得基本原理第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增PCR反应条件PCR过程PCR得特点第4轮扩增灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR反应条件PCR过程PCR得特点PCR得特点PCR得反应体系标准得PCR反应体系 10X 扩增缓冲液:5μl 模板DNA: 0、1~2μg 引物: 各0、2~1μmol/L 4种dNTP:各200μmol/L Mg2+