质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.docx

质粒 DNA 得提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目得 1、学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA得方法; 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定得方法; 3、学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度与纯度得原理与方法; 4、学习并掌握PCR 基因扩增得实验原理与操作方法; 5。学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳得原理与使用方法。 二、实验原理 1、PCR(多聚酶链式反应) 在 DNA 聚合酶催化下,可以DNA为模板, 以特定引物为延伸起点, 以 dNTP 为原料,通 过变性、退火、延伸等步骤, 在体外(缓冲液中)复制DNA,使目得 DNA 按 2n 方式呈指 数形式扩增。 PCR 一次循环得具体反应步骤为: A。变性:加热反应系统至 95℃ ,使模板 DNA 在高温下完全变性,双链解链 。 B。退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35—70℃,一般低于模板 Tm 值得 5℃左 右),与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C。延伸:溶液反应温度升至中温 72℃,在 Taq酶作用下 ,以 d NTP为原料,引物为复制 起点,模板 DNA 得一条单链在解链与退火之后延伸为一条双链。 2、质粒 DNA得提取与制备 (1)、碱裂解法: 染色体DNA 与质粒 DNA 得变性与复性存在差异: A、高碱性条件下,染色体DNA 与质粒 DNA 均变性; B、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性得质粒DNA 复性并保存在溶液中,染 色体DNA不能复性而形成缠连得网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除、 (2)。离心层析柱: A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中得质粒DNA,而不吸附溶液 中得蛋白质与多糖等物质; B.通过去蛋白液与漂洗液将杂质与其它细菌成分去除; C。低盐,高pH值得洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 得定量分析(紫外分光光度法): A、物质在光得照射下会产生对光得吸收效应,且其对光得吸收就是具有选择性; B、各种不同得物质都具有其各自得吸收光谱: DNA 分对波长 260nm 得紫外光有特异得吸收峰 蛋白质对波长 280nm得紫外光有特异得吸收峰 碳水化合物对 230nm 得紫外光有特异得吸收峰 C。A260/A280及 A260／A230 得比值可以反应 DNA 得纯度; A260／A280=1、8 DNA 纯净 A260/A28 0 〈1、8 A2 6 0／A 2 8 0＞1.8 表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质 含 RNA 杂质,用 RNA 酶去除。 4.质粒DNA 得酶切鉴定: 限制性内切酶就是 DNA重组操作过程中所使用得基本工具。 限制性内切酶能特异性地 与一段被称为限制酶识别序列得特殊 DNA 序列结合,或就是与其附近得特异位点结合, 并在结合位点切割双链 DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖就是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性得滤孔,凝胶孔径得大小决定 于琼脂糖得浓度。 DNA 分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:不同得DNA,分子量大小及构 型不同,电泳时得泳动率就不同,从而分出不同得区带(迁移速度与分子量得对数值成反 比关系)、 三、材料与方法: (一)实验材料: 1 。PCR 仪器:PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌得薄壁离心管 材料:菌液【大肠杆菌 DH5 a 菌株(pMD 1 9－T质粒,含目得片段—绿色荧光蛋白 GF P)】、无菌去离子水、 2×Prem i x Taq、引物 2. 质粒 DNA 得提取与制备 仪器:恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、 Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 材料:溶液 P 1 ( S 1)、溶液 P2 (S2)、溶液 P3(S 3 )、去蛋白液PE(W1)漂洗液 WB(W2)、洗脱液 EB(Eluent)、含 p MD 1 9 —T 质粒得大肠杆菌 DH5 α 3 。 质粒 DNA 得定量(紫外分光光度法) 仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料:蒸馏水、质粒DNA 4 。质粒 DNA 得酶切鉴定 仪器:1、5ml 得 EP 管、微量加样枪 材料:无菌水、 1 0 ×M 酶切缓冲液 Buf R、质粒DNA、Hind III (1 5U/ul)、Ec oR I(1 2 U/u l ) 5。琼脂糖凝胶电泳 仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料:电泳指示剂、Ge lview、TBE、琼脂糖、 DNA Mark e r 5 000、电泳缓冲液 (二)实验方法 1 。PCR 准备目得 DNA:菌液煮沸 10min,冷冻,室温解冻后离心取上清液 取 0、2 ml P