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三、培养方法 植物细胞的主要培养方法 按培养对象分可分为：原生质体培养和单细胞培养； 按培养基类型可分为：固体培养和液体培养； 按培养方式可分为：悬浮培养和固定化细胞培养。 第三十一页，共五十六页，2022年，8月28日 固体培养：在培养基中加入一定量的凝固剂（如琼脂），经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基，在该培养基上进行植物组织培养的方法称为固体培养。 固体培养最常用的固化剂是琼脂，最适浓度为0.6%-1.0%，一般培养温度为（25±1）℃，需光照，以每天16h为宜。 细胞培养的常规操作是固体培养和液体培养相互配合使用。 第三十二页，共五十六页，2022年，8月28日 实际生产中，要实现大规模的培养，主要采用成批培养、半连续培养和连续培养。 1.成批培养法 成批培养：将培养基一次性加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。 最适于植物细胞培养的生物反应器是气升式反应器。 第三十三页，共五十六页，2022年，8月28日 在植物培养过程中，次级代谢产物的大量积累一般发生在细胞生长的稳定期，为避免次级代谢产物的大量积累，常采用两步培养法。 使用两个生物反应器。第一个用于细胞生物量的积累，第二个用于次级代谢产物的生产。 紫草宁 第三十四页，共五十六页，2022年，8月28日 2.半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。 每隔一天或两天收获一部分培养物（最多可达50%），然后补充等量新鲜培养基。 第三十五页，共五十六页，2022年，8月28日 3.连续培养 连续培养是在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 连续培养法要维持系统的无菌状态，技术条件比较苛刻。 第三十六页，共五十六页，2022年，8月28日 4.固定化培养法 采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜等多种类型。 优点： （1）细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体； （2）易于维持细胞间物理化学梯度； （3）有利于细胞组织化； （4）易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。 第三十七页，共五十六页，2022年，8月28日 固定化培养常采用固体培养，优点是操作简便易行、培养所占空间小。 缺点是： （1）培养基中营养物质的浓度差导致愈伤组织生长不平衡； （2）气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，堆积有害物质； （3）静止状态下，由于重力作用和向光性导致细胞群体不均匀； （4）培养时需测定一些生理生化指标，此时需转入液体中，会改变组织的形态和生理状态。 第三十八页，共五十六页，2022年，8月28日 第五节 影响植物次级代谢产物积累的因素 在植物组织培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累计的因素有： （1）生物条件：如外植体、季节、休眠等 （2）物理条件：如温度、光、通气等 （3）化学条件：如无机盐、碳源、维生素等 （4）工业培养条件：如培养罐类型、通气等 第三十九页，共五十六页，2022年，8月28日 一、外植体选择 不同外植体的悬浮细胞培养物，它们的最大次级代谢产物的积累时间各异，同一化合物可以在不同的外植体的不同生长阶段中积累，无论是延迟期、加速期、对数期还是稳定期都能够大量积累次级代谢产物。 第四十页，共五十六页，2022年，8月28日 第一页，共五十六页，2022年，8月28日 植物细胞工程的主要研究内容：植物细胞全能型的本质、细胞分化机制、代谢途径的调控、培养细胞中的生理和遗传的变异、体细胞杂交和有性杂交的比较、不亲和的机制、细胞大规模培养的动力学参数的建立等、细胞和组织培养方法的改进、细胞器的分离和引入、原生质体诱导融合和杂种的培养筛选和鉴定、花粉和花药培养、培养细胞中有用成分的鉴别及分离方法的建立、试管苗的大规模繁殖和生产等。 第二页，共五十六页，2022年，8月28日 第一节 概述 1.植物细胞的全能性：植物体中的任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。1953年，单个胡萝卜细胞培养成整株植株。 基本概念 2.植物组织和器官培养：是指在无菌和人工控制条件下（培养基、光照、温度等），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其