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2. 装柱 将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，把处理好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长8cm，最后放入略小于层析柱内径的滤纸片保护凝胶床面。注意：整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装柱。 3. 平衡 用蒸馏水洗脱，调整流量，使胶床表面保持2cm液层，平衡20min。 4. 样品制备 取2mL抗凝血放入试管中，加入等体积的铜盐溶液，混匀待用。 5. 上样 当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取0.5mL血红蛋白与铜盐混合样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央，注意切勿冲动胶床，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm液层时，用乳头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入3～5cm高的洗脱蒸馏水。 6. 洗脱 继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。观察并记录实验现象。最后用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。 四、结果 描述并解释实验现象，讨论凝胶过滤的效果。 五、思考题 1. 凝胶过滤又称为分子筛，大小不同的分子经过凝胶过滤被洗脱出来的次序与一般普通过滤有什么不同？为什么？ 2. 凝胶过滤在生物化学实验研究中有哪些用途？ 实验7 DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、目的与要求 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法和原理 二、原理 凝胶电泳是分离与测定生物大分子的一项重要技术，琼脂糖糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定及纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简单、快速，可以分辨用其他方法不能分辨的DNA 片段。DNA 溶液在pH8.0时带负电，在电泳电场中向正极移动，用聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，其分辨力极高，相差1 bp的DNA 片段都能分开。琼脂糖凝胶的分辨能力虽低，但其分离的范围较广，可以分离长度为200 bp～50000 bp的DNA 。 本实验采用的是琼脂糖凝胶电泳，它常用于按分子量大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，在不同浓度的凝胶上，DNA片段迁移的速度也不相同，凝胶浓度越大，凝胶的纤维网孔越密，越能有效地分离不同分子量的分子，尤其是分离小分子质量的分子。利用溴酚蓝染色剂可以判断电泳迁移距离，电泳时间不能过长，否则迁移速度快的小分子量的DNA片段会跑到缓冲液中去。 观察琼脂糖凝胶中的DNA 片段最简便的方法是利用荧光染料溴化乙锭（或其替代品GoldView）进行染色，溴化乙锭可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，从而与DNA 结合，并呈现荧光，显示出不同分子量的DNA 带图谱，用已知大小的标准样品与未知片段的迁移距离相比较，就可以决定未知DNA分子量大小。 三、操作步骤 （一）琼脂糖凝胶板的制备： 1．琼脂糖凝胶的制备 称取0.3 g琼脂糖于100 mL烧杯中, 加入30 mL TBE缓冲溶液, 在电炉上加热溶解，待完全融化后放置室温冷却至60℃左右。加入3 μl GoldView，混匀。 2．板的制备 将上述冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入水平放置的制胶模具中，放上梳齿。待胶凝固后取出梳齿，将胶板放入电泳槽中，胶面应浸没在TBE缓冲液液面以下2~3 mm。 将冷却至65 ℃的琼脂糖凝胶液小心地倒进有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。在室温下静置lh，待凝固完全后，取下橡皮膏，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中，倒入TBE稀释缓冲溶液，直至浸没过胶面2～3 mm。 双手轻轻地且用力均匀地拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。 （二）加样 用微量加样器按下表配制样品与标准， 混合后加样。 孔 1（泳道1） 孔 2（泳道2） 分子量标准（Marker）/μl 5 0 DNA样品/μl 0 5 点样液/μl 0 1 （三）电泳 加完样品后的凝胶板立即通电，于150v电压下电泳20~30min。 在低电压条件下，线性DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA片段泳动速度的增加是有区别的，因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。 电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5％时，由于胶太稀，最好在4 ℃下进行电泳，以增加凝胶硬度。 （四）观察和拍照