大头典竹ISSR反应体系建立与优化.docxVIP

? ? 大头典竹ISSR反应体系建立与优化 ? ? 瞿印权 徐雯 沈露 何天友++魏建文 荣俊冬 郑郁善 Summary：以大头典竹叶片为材料，采用单因素分析法和正交设计直观分析法，对影响PCR扩增效果的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行筛选。通过研究建立了适合大头典竹的ISSR-PCR反应体系：20 μL反应液中含2.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O。相应反应程序为94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性45 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。应用建立的优化反应体系成功地筛选出16条多态性较高的引物，表明该体系具有较高稳定性、重现性、适用性，可较好地应用于大头典竹不同地理种源间的遗传多样性研究。 Key：大头典竹；ISSR；反应体系；优化 ： S795.901文献标志码： A ：1002-1302（2017）10-0034-06 地球上的竹类植物共有88属1 400多种，主要分布在亚太区、美洲区、非洲区[1]。中国竹类主要分布于长江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全国竹林面积的60.7%[2]。大头典竹[Dendrocalamopsis beecheyana var. pubescens （P. F. Li） Keng f.]属于竹亚科（Bambusoideae）绿竹属[Dendrocalamopsis （Chia et H. L. Fung） Keng f.]的丛生竹，别称新竹、荣竹，具有繁殖生长快、根系发达、适应性广等特点。目前，在我国关于大头典竹在分子生物方面的研究较少。[JP] 近年来，随着现代分子生物学的快速发展，分子标记技术被广泛应用于遗传多样性以及指纹图谱构建的研究[3-5]。目前应用最为广泛的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等[6]。其中SSR序列广泛分布在高等生物的染色体上，因此利用该简单重复序列标记（inter simple sequence repeat，ISSR）技术可以获得较多的分子标记。ISSR的引物长度较RAPD引物长，因此ISSR具有重现性的特点，可以获得较可靠的遗传多样性信息，有利于植物种间及种内的鉴别[7]。已有研究表明，竹亚科植物不同地理种源间的遗传变异较丰富[8]，为了进一步证实上述观点，本试验采用ISSR方法对大头典竹的群居差异进行研究，旨在建立 ISSR-PCR最佳反应体系，为其地理种源的遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定奠定理论基础。 1材料与方法 1.1材料 供试的材料来源于福建省东山国有赤山林场的大头典竹地理种源试验样地。采摘洗净的竹叶3～5张，放入自封袋并冰袋保存，尽快转移至-80 ℃冰箱，以备DNA的提取。 [BT2+*5]1.2试剂与仪器 主要试剂：ISSR引物都参考哥伦比亚大学公布的100条引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10×PCR Buffer、6×loading Buffer均购上海生物工程技术服务有限公司；琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。 主要仪器：JS-680全自动数码凝胶成像分析仪、T6新世界紫外分光光度计、Lab Cycler PCR仪、DYY-8C电泳仪、TGL-20M台式高速冷冻离心机等。 1.3DNA的提取与检测 大头典竹DNA的提取采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取的方法。将提取出的DNA用紫外分光光度计检测其浓度、纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性及是否有降解现象。 [BT2+*5]1.4ISSR原初扩增程序和反应体系 原初设定的扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。原初扩增反应体系为2.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，50 ng 模板DNA，2 μL 10×Buffer，9.8 μL ddH2O。原初扩增程序和反应体系均参考李炎梅的方法[9]。 1.5试验设计 [JP+1]经过初步的引物筛选，引物UBC810能产生清晰度高、多态性好的条带，因此可以用于ISSR-PCR体系的筛选（图1）。分别采用单因素多水平梯度试验法和