基因工程第二章 基因工程的工具酶.pptVIP

只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。 局部消化 1 2 3 4 1 4 部分酶切（Part Digestion） 现在是31页\一共有52页\编辑于星期三 第二节 DNA连接酶（ DNA Ligase ） 1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。 2.1 基本性质： 能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。 现在是32页\一共有52页\编辑于星期三 2.2 T4 DNA连接酶的作用机制： ① ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 ② E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上， 使其活化，释放出酶。 ③ 活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。 现在是33页\一共有52页\编辑于星期三 现在是34页\一共有52页\编辑于星期三 8.1.3 两种DNA 连接酶 比较 T4 DNA ligase E .coli DNA ligase 来源 T4 噬菌体 大肠杆菌 分子量 68 kD 75 kD 辅助因子 ATP NAD+ 底物 1) 双链DNA分子的粘、平端 1)同源互补粘端 2) RNA-DNA杂合体、RNA链缺口 2)双链分子中的单链缺口 3) 双链DNA分子中的单链缺口 应用范围 广泛 . 效率高 窄 现在是35页\一共有52页\编辑于星期三 修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键 现在是36页\一共有52页\编辑于星期三 修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 现在是37页\一共有52页\编辑于星期三 第一节 限制性内切核酸酶（Restriction Endonuclease） 能专一性识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开。 来源：细菌、霉菌和蓝藻 功能：细胞内限制性修饰系统的一部分，可以降解“入侵”的外源DNA 现在是1页\一共有52页\编辑于星期三 限制性内切酶作为细菌体内保护自身、避免被噬菌体入侵的作用机制。 现在是2页\一共有52页\编辑于星期三 一、限制性内切酶的命名和种类 1.命名： 生物的属名的第一个字母和种名的第一、二个字母命名，菌株的代号的一个字母，和罗马数字表示。 现在是3页\一共有52页\编辑于星期三 EcoR I Escherichia 属名 Coli 种类 Ry13 株系 编号 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株名； 用罗马数字表示发现的先后次序。 现在是4页\一共有52页\编辑于星期三 2.限制性内切酶的种类： 平端 5′突出粘端 3′突出粘端 现在是5页\一共有52页\编辑于星期三 识别序列：在双链DNA分子能够识别的特殊核苷酸序列;一般为4-8bp 1）二重旋转对称识别序列（回文序列） 现在是6页\一共有52页\编辑于星期三 3. 限制酶的特点 1). 识别顺序和酶切位点 ①识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ 现在是7页\一共有52页\编辑于星