实时荧光定量PCR技术实验操作流程.docxVIP

— — PAGE 1 — 实时荧光定量PCR技术实验操作流程 实时荧光定量 PCR，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP 分析等。荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合，嵌入至 dsDNA，荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，PCR 扩增不同时期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 荧光信号强度不同。可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。配套 LightCycler 480 使用的试剂盒 LightCycler 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液，dNTP mix，SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。注意：SYBR Green I Master 需避光放置。所需仪器与耗材有： LightCycler 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。朗基T30PCR 仪、rainin单道移液器、Nunc 冰盒及NEST盒装吸头等。实验操作流程：1.用新鲜提取的 RNA 反转 录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括：SYBR Green 反 应体系的配置；PCR 程序设置；运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。2.反转录反应 :反转录合成 cDNA 第一链实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13l，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10l、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1l、5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2l，混匀。然后进行样品一号管的体系配置，依次加入 1l 已调整浓度的总 RNA、1l oligo dT 引物、2l 随机六聚体引物、最后加 9l 水补充至总体积 13l，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总RNA的模板量适当调整至 10ng-5g，mRNA调整至 1-100ng。若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10g/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂：2 号管的 5反转录酶 buffer，4 号管 dNTP mix，3 号管 40 U/l 的 RNase 抑制剂，1 号管 20 U/l 的反转录酶，最终体积为 20l。若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为：25℃，10min，55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶，再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。3.Q-PCR 扩增cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。20l 的 PCR 反应体系可取 2-5l cDNA 反应产