内毒素及其去除.pptxVIP

内毒素及其去除第1页/共24页 内毒素及其去除内毒素结构和性质内毒素的危害及检测内毒素去除的方法第2页/共24页 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰内毒素也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌胞壁上一种成分（少数阳性菌也能产生）。其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成 ，死亡时则会释放大量内毒素。一个大肠杆菌细胞约含有200万个LPS分子内毒素是什么第3页/共24页 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰多糖链脂质A磷酸基团疏水性，毒性部分结构复杂，特异性部分带负电功能部分第4页/共24页 构建生物经济体系 打造生物经旗舰结 构不同的革兰氏阴性细菌,其 LPS的化学组成有一定的差别,但都含有内脂 A 部分第5页/共24页 内毒素性质极高的热稳定性250℃30分钟带负电等电点在2左右亲水兼疏水糖亲水脂疏水第6页/共24页 单体胶束囊状内毒素存在形式构建生物经济体系 造生物经济旗舰第7页/共24页 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰内毒素的危害0.5—1小时冷颤发热，头痛恶心，呕吐，脸色苍白血液循环障碍休克死亡医药制剂本身不合格或放置时间过长输液器未消毒彻底注射器操作污染2ng/kg体重即能引起发热第8页/共24页 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰药品、生物制品的细菌内毒素限值（L，EU/mg）一般按以下公式确定： ?K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，单位 EU/（kg · h）M 为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，单位mg/（kg · h）生物制品中内毒素标准细菌内毒素标准在制定时应定为计算值的1/3~1/2。 我国药典要求注射剂中细菌内毒素＜1EU/ml第9页/共24页 凝胶法浊度法显色基质法内毒素与鲎试剂的凝胶反应大于0.03EU/ml范围缓慢翻转180°，目测终点0.006-300EU/mL浊度变化0.006-15EU/ml显色基团吸光度变化简单,经济,不需专用测定设备特异性不强精密度、定量性差简单、快速、灵敏度高、检测范围宽需精密的专用仪器精度高、灵敏度高仪器和试剂贵,操作比较复杂部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验常用内毒素检测方法第10页/共24页 内毒素去除的难点构建生物经济体系 打造生物经济旗舰自身特点极少的养分G-即可存活，内毒几乎无处不在单体、聚集体种类繁多性质不均一热稳定性高180℃ 3 hours相互作用本身带负电，可以和带正电的碱性蛋白结合通过二价阳离子(如Ca2+) 的桥接作用和酸性蛋白形成复合体类脂A的疏水特性导致其和疏水性蛋白结合内毒素第11页/共24页 去除内毒的方法 1.高温烘烤热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。此法适合玻璃器皿的去内毒2.碱消毒（室温条件下）主要用于玻璃、 塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除第12页/共24页 4.蒸馏法，超滤法，反渗透，此法一般在生产注射用水时用到，蒸馏需要多级蒸馏并且加隔沫装置，反渗透成本高。5.吸附法，内毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于对蛋白有吸附故不适合用于生物制品。6.层析法，选用合适的层析填料和溶液体系，能够有效去除产品中的内毒素，是目前单抗纯化生产中的主流工艺。内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介绍几种生产中常用的方法构建生物经济体系 打造生物经济旗舰7.相分离法、适用于蛋白制品，但各有缺点。第13页/共24页 相分离法Triton X-114一 阴离子交换层析二 亲和层析四 疏水层析与分子筛三第14页/共24页 相分离法Triton X-114此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml，去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的 Triton X-114 残存在蛋白溶液中构建生物经济体系 打造生物经济旗舰第15页/共24页 离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言,内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要在柱再生(1M氯化钠) 或在位清洗(1M氢氧化钠)时才从介质上洗脱下来构建生物经济体系 打造生物经济旗舰阴离子交换层析第16页/共24页 内毒素在pH〉2时都是带负电。阴离子层析填料自身带正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在填料上，目的蛋白直接流穿如二乙胺乙