分子生物学基因工程和核酸杂交.pptxVIP

分子生物学基因工程和核酸杂交第1页/共146页 24.1 工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S1第2页/共146页 31、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。第3页/共146页 4第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。Hin dⅢ 属 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性核酸内切酶命名第4页/共146页 5作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ三种限制性核酸内切酶的作用酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶DNA链上的 无 有 有特异识别位点DNA链上的 无 在识别序列内 在识别序列外特异切割位点在分子克隆中 无 有 无的重要意义第5页/共146页 6限制酶能识别双链DNA特异的4?8个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。限制酶功能：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。限制性核酸内切酶的作用第6页/共146页 75?——GAATTC——3?ATATGC5’ 3’ EcoRⅠ的识别序列：对称轴3?——CTTAAG——5 ?第7页/共146页 8粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。—GAATTC——CTTAAG—EcoRⅠ—CCC GGG——GGG CCC—SmaⅠ第8页/共146页 9第9页/共146页 10第10页/共146页 11第11页/共146页 12同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。 同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。如：BamH Ⅰ和Bst Ⅰ（G GATCC） Xho Ⅰ和 Pae R7（C TCGAG） 如： BamH Ⅰ（G GATC C） Sau 3A Ⅰ（N GATC N）。 由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。第12页/共146页 131） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（ E . Coli DNA polymeraseⅠ ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性： ① 5? →3? DNA聚合酶活性 ② 3? →5? 核酸外切酶活性 ③ 5? →3? 核酸外切酶活性2、DNA聚合酶 第13页/共146页 14 5?→3?外切酶 5?→3?聚合酶 3?→5?外切酶 (103kD)Klenow 片段 N C 5?→3?聚合酶 3?→5?外切酶(68kD)35kD (小) 68kD(大)N枯草杆菌蛋白酶 DNA聚合酶Ⅰ 第14页/共146页 15补齐双链DNA的3?末端，同时可使3 ?末端DNA标记上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二链。DNA序列分析。Klenow片段的主要用途第15页/共146页 16Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，T