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乳酸测定方法--第1页 乳酸的测定： 对羟基联苯比色法（参照高庆，2005） 1.材料、试剂与仪器 无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。 主要溶液： ①钨酸溶液：L 硫酸及 10%(W/V)钨酸钠 (NaWO ·2H O)溶液等体积混合，当天使用前配制； 2 4 2 ②20%(W/V)硫酸铜溶液：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)20g，加蒸馏水70ml，加热使之溶解，再加入蒸馏 水定容至 100ml； ③对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯溶于 100ml 的 L 氢氧化钠溶液中( 配制时加热助溶，溶解后为澄 清液体) ，贮存于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱，可使用一个月； ④乳酸标准储存液(1mg/ml)：精确称取无水乳酸锂，溶于50ml 蒸馏水中，加 L 硫酸 20ml，后加蒸馏 水定容至 100ml，混匀后保存于 4℃冰箱。 ⑤4%(W/V)硫酸铜溶液：20%硫酸铜溶液 10mL 加蒸馏水稀释至 50mL。 ⑥乳酸标准应用液(200µ g/mL):使用时取储存液 10mL 用蒸馏水稀释至 50mL。在冰箱中可保存数天。 主要仪器： UNIC UV-2100 紫外可见分光光度计、TGL-16B 离心机、恒温水浴锅、具塞试管 5ml 及具塞比色管 20ml。 2. 方法 青贮浸提液样品预处理 取适量青贮浸提液样品5000r/min 离心 10min，取上清液适当稀释，吸取稀释液于洁净离心管中，加入 钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物（约30～45min），10000r/m 离心 10min，取 上清液置于 5ml 洁净具塞试管中，60℃水浴保温 30min 左右，冷却待用。 标准曲线的制作 ①用 200Lg/mL 乳酸应用标准液 同青贮样品浸提液预处理方法一样预处理后 (可以不稀释),按下表数量在预先编好号的试管中加入标 准乳酸滤液和蒸馏水。 ②各管中分别加入氢氧化钙粉末 100mg,混匀,8000r/min 离心 5min,取上清液,加入预先加有 20mg 氢氧 化钙粉末的小试管中 ,混匀 ,加 20% 硫酸铜溶液 ,称重 ,迅速混匀 ,沸水浴 3min,水浴冷却 ,补足重 量,3000r/min 离心 5min,各吸上清液加入比色管中。③在各管加入 25µ L 的 4%硫酸铜溶液,混匀后置冰 水浴内冷却。④将预冷的浓硫酸缓缓加入各管中,每管各加,边加边摇,混匀后置沸水浴中准确加热 5min, 取出后迅速置冰水浴中冷却 3min 左右。⑤在各管中加 %对羟基联苯溶液 ,充分振摇后,放置,其间每 10min 混摇一次。⑥各管置于沸水浴中准确加热 90s,立即放入冰水浴中冷却。在波长 565nm 处用 lcm 比色皿,1 管作为参比,分别测定吸光度(A)。所得数据以乳酸含量为横坐标,以565nm 处的光吸收为纵坐 标,作标准曲线。 青贮样品浸提液中乳酸含量的测定 取青贮样品浸提液滤液按标准曲线的测定方法,以蒸馏水为空白测定其在 560nm 处的光吸收,所得 数据在标准曲线上查得相应的乳酸含量,即为青贮样品浸提液中的乳酸含量。 样品中乳酸含量=计算值×稀释倍数 需要试剂： 乳酸测定方法--第1页 乳酸测定方法--第2页 无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。 需要器材： 分光光度计、离心机、离心管、恒温水浴锅、具塞试管5ml及具塞比色管20ml。 乳酸测定方法--第2页