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猪冷冻精液技术研究
夏天 高金銮1付光栋2姚德成3黄江春3陆肖芬′陈杰 · 周三华 · 万长华2
(1. 海南(罗牛山)养猪研究所海南海口571126; 2.罗牛山畜牧公司海南海口571126: 3.罗牛山人工授精站海南海口571126 4.罗牛山新华猪场海南海口571126)
摘要:通过反复试验,选择活力0.7级以上的新鲜公猪精液,过滤后立即用BTS 液按1: 1稀释在17℃冰箱中平衡2.5~3h后,用2000g/min,离心8min, 去上清液后,用加海藻 糖的TCG 卵黄液按1:1稀释,后在0~4℃冰箱中平衡2h, 然后按体积加入甘油,甘油 最终浓度为3%,再分装至0.5ml塑料细管中,置于0℃冻箱中平衡1h, 在铝盒中距液氮 面3cm 处冷冻,结果表明,经液氮储存的猪精液在52℃水温下解冻12s, 解冻活力在0.3
级以上,输精6头母猪,共产仔55头,平均9.16头,活健仔53头,平均8.82头。
自1950年英国polge 发明冷冻精液技术以来,首先在奶牛群中普及,随后在其它牛 属动物中扩大推广,其后又在羊属动物中推广。但在猪群的推广较少见,猪的精液量很 大(平均为170ml) 且不易冷冻,几十年来,虽有研究报导,但受胎率低、产仔数少,应 用极不普遍。近年来国外种猪公司,虽有少量应用,但其价格昂贵不易推广应用,国内
目前虽有多家院校进行研究,但至今无一家正式应用于生产。
为了海南种猪事业的发展,和便于国家核心育种场交流种猪血统以及地方优良猪种特 别是濒危猪种的保护,我们从2008年开始历时5年,进行了猪冷冻精液技术的研究,现
将研究情况报告如下。
1 试验地点与材料
1.1 试验时间
2008年~2010年4月
1.2试验地点
中科院海口科学实验室、罗牛山猪人工授精站实验室、海南养猪研究所实验室、罗
牛山新华猪场
1.3试验材料
液氮、干冰、无水酒精、 -80℃低温冰箱、17℃恒温冰箱、普通冰箱、相差显微镜、
显示器、空调。BTS稀释液(自配)、TCG+海藻糖稀释液(自配)、新鲜鸡蛋黄、甘油、0.25ml、
0.5ml、2.5ml细管、秒表等。
1.4试验方法
正交试验法、以2~3个评定员凭经验评定冻后活力,记录按评定的平均值计算,0.3
以上活力为合格。随机挑选母猪作输精试验。
2试验内容与结果
2.1 探索另类冷冻技术
先进行预备试验,探索另类冷源。我们利用中科院海口科学实验室的-80℃冰箱,将 无水酒精预冷冻到-80℃,将处理好的精液装入饮料细管中,用聚乙烯醇粉封口,以及装 入生化用的耐冻塑料细管中(直径10mm 盖上盖子)浸入已预冷至于-80℃无水酒精中(酒
精的冰点为-112℃)经7次试验见表1:
试验次数
冻后活力
饮料细管
塑料安瓶
1~7次
0.00
0.00
由于降温控制不好,精液密封不严,有酒精渗入,试管口径过大,7次试验冷冻后
活力均为0.00级,但视野中仍有个别直线前进运动的精子。
2.2三种冷源的比较
为了比较另类冷源与正规冷源(干冰、液氮)的优劣,我们仍用无水酒精。无水酒 精是装入大口试管后在干冰中预冷到-78℃,所用细管为日本产正规0.25ml 冷冻精液用
细管,外面加一个料薄膜套。正交试验结果表2:
试验号
A:AGE配方中添加
B:甘油浓度
C:分装及冷源
三人评均活力评分
1
海藻糖
1
4%
3
洒精细管
0.11
2
氨基乙酸
1
4%
1
干冰颗粒
0.28
3
海藻糖卵黄
1
4%
2
液氮颗粒
0.45
1
海藻糖
2
5.5%
2
液氮颗粒
0.23
2
氨基乙酸
2
5.5%
3
洒精细管
0.00
3
海藻糖卵黄
2
5.5%
1
干冰颗粒
0.28
1
海藻糖
3
7.0%
1
干冰颗粒
0.19
2
氨基乙酸
3
7.0%
2
液氮颗粒
0.16
3
海藻糖卵黄
3
7.0%
3
洒精细管
0.10
A1
0.18
B1
0.28
C1
0.25
A2
0.15
B2
0.17
C2
0.28
A3
0.28
B3
0.15
C3
0.07
本次试验结果显示,冷冻液配方的海藻糖+卵黄液为好,三种甘油浓度以4%甘油的低
浓度为好。冷源选择以酒精细管为差,加上在干冰中预冷的无水酒精不适合大量制作猪
精液冷冻,故在后续试验中淘汰出局。
2.3配方中海藻糖剂量的优选
在冷冻保护液中,加入海藻糖是近年新发现的一项研究成果,我们先后在 TCG 冷冻 保存液中加入1.25%、1.65%两个剂量,取得了制造合格精液的目标,但也有失败的记录,
后来又进行了加入3.5g/100mlTCG 进行优选。
在每100mlTCG冷冻保护液中分别采用1.25g 、1.65g和3 . 5g 进行比较,制出合格
精液的次数为4/10、6/10、7/10。于是在TCG 配方中的加入海澡糖剂量选定
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