《梨枯梢病监测与检测技术规程》.pdfVIP

前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵延存、孙伟波。 I 梨枯梢病监测与检测技术规程 1 范围 本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果 判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。 本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T2292 亚洲梨火疫病监测技术规范 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求 3 原理 梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌 （ErwiniapyrifoliaeKim et al.），是为害梨树的重要细菌病害之 一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和 分子生物学特征等进行监测与检测。 4 试剂与材料 检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 5 仪器与用具 超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、 电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移 液器、制冰机等。 6 监测技术 6.1 监测植物 梨，主要监测亚洲梨。 1 6.2 监测区域 重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。 6.3 监测方法 6.3.1 苗木监测 对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T 1157要求进行抽样，并对样品进行 室内检测。 6.3.2 田间监测 从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏 查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状 （见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样， 样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信 息进行记录 （见附录C）。 在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7d调查一次。采用5 点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取 按照NY/T2292中的规定执行。 7 检测技术 7.1 样品处理 选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取 病健交界处组织约 （3mm～5mm）× （3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心 管中轻轻挤压，浸泡10min～30min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品 悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。 7.2 检测方法 7.2.1 显微镜检查 2 对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20mm ，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低 倍显微镜下观察有无喷菌现象。 7.2.2 培养特征检测 将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28℃倒置培养24h～72h。在YPDA培养基平 板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征 以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录 （参见附录B）。 7.2.3 形态特征检测 按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭