丙型肝炎病毒抗体检测标准操作规程.docx

丙型肝炎病毒抗体检测标准操作规程 ××医院检验科临床免疫室作业指导书 文件编号:XXX 生效日期： 共 页 第 页 1. 目的 建立检测血清中丙型肝炎病毒抗体含量的标准操作规程，保证实验结果的精确性及正 确性。 2. 原理 2．1 ·采用酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA) 进行检测：采 用双抗原夹心法进行检测，用合成 HCV多肽抗原或基因重组 HCV抗原(包括结构区抗原及 非结构区抗原) 包被酶联板，以辣根过氧化物酶(HRP) 标记抗人IgG，洗涤除去未结合的游离 酶，以四甲联苯胺(TMB) 为底物，显色测定。 2．2 ·采用电化学发光法进行检测：采用“三明治”法，吸取 40μl样本与 60μl生物素化 HCV抗原以及60μl钌复合体标记的 HCV抗原一起孵育，反应形成“三明治”样抗原 抗体复 合体；再添加包被链霉素的磁珠微粒进行孵育，抗原 抗体复合体与磁珠通过生物素和链霉素 的作用相结合；将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面，未与磁珠结合 的物质被去除。然后，给电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发 光强度，通过检测仪的校准曲线得到最后的检测结果。 3. 标本要求 根据试剂盒说明书要求收集存储样本，血清标本采集用标准样本试管或含分离胶的试 管，血浆样本采集使用肝素(Li ，Na ) 或 K3 EDTA，一般来说，标本在 2~8℃可稳定 7 天，－20℃可稳定6个月。 4. 试剂与仪器 4．1 ·试剂组成和仪器(酶联免疫吸附法) ：试剂组成一般如下：包被抗原板、底物 A液、 底物 B液、阳性对照、洗涤液、阴性对照、终止液、抗人 IgG HRP酶结合物、TMB显色液，采 用仪器为酶标比色仪。 4．2 ·试剂组成和仪器(电化学发光法) ：试剂组成一般如下：链霉亲和素包被的微粒、 DTT、生物素化的 HCV 特异性抗原、Ru(bpy)2＋3标记的 HCV 特异性抗原、Cal 1 校准液 和 Cal 2校准液、Anti HCV质控品 1 和 2 。采用仪器为全自动电化学发光分析仪。 5. 操作步骤 5．1 ·ELISA方法(具体操作参照试剂说明书或所在科室制定的 SOP) 5．1．1 将已包被的反应板置于台上恢复至室温，按顺序编号。 5．1．2 加样：测定孔每孔加待检血清 50μl，设阴性对照 2 孔，阳性对照 2 孔，每孔各加 50μl(或 1 滴) ，设空白对照 1 孔(空白孔只加底物和终止液)，可设置外部质控品 1 孔，用即时 贴封板，37℃水浴30 min。 5．1．3 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液连续洗5次，每次静置 15 s，吸干孔内液体，用吸水 纸拍干。 5．1．4 加酶结合物：取出抗人 IgG HRP，充分混匀，每孔各加 2滴。用胶布封板，37℃ 水浴 20 min。 5．1．5 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液连续洗5次，每次静置 15 s，吸干孔内液体，用吸水 指纸拍干。 5．1．6 加底物液：每孔先加入 A液 1 滴，再加入 B液 1 滴混匀，37℃避光，显色 10 min。 5．1．7 加终止液，每孔加入 1 滴终止液，终止反应后 10 min 内测定，空白孔调零，测定波 长为450nm，进行相应的比色测定。 5．2 · 电化学发光法(具体操作参照试剂说明书或所在科室制定的 SOP) ：开机后仪器自 检，自动保养，然后进入“StandBy”状态。仪器准备：每日开机维护及载入试剂、定标和质控。 样本检测，结果浏览和复查。 日常维护，关机。 6. 校正(电化学发光法) 每开启一批新的试剂，需在输入批数据后进行校准，之后按照试剂说明书(如每隔 28 日 或出现结果异常等情况时) 需再进行一次校准。校准品在同一次运行中必须重复测定 2 次， 且校准值必须在设定的范围内。如果不在该范围内，则应重新校准。 7. 质控(电化学发光法) 一般采用两种浓度水平的质控品，至少每24h或每一次校准后测定一次。质控间隔期应 适用于各实验室的具体要求。质控品检测值应落在设定的范围内，如出现质控值落在范围以 外，应查找原因，采取相应的校正措施。 8. 结果判断 8．1 ·ELISA方法(具体操作参照试剂说明书或所在科室制定的SOP) ：终止后测 OD值。 按下列公式计算：样品 OD值 S／CO≥1．0者为阳性，样品 OD值 S／CO＜1．