克隆基因的表达.pptxVIP

克隆基因的表达第1页/共121页第2页/共121页 原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。第3页/共121页pIJ486 是链霉菌的质粒（如下图所示），其中 neo 和 tsr 分别为新霉素和硫链丝菌素的抗性基因。为了准确克隆并筛选出目的 DNA 片段的克隆，最为理想的插入位点是？说明其原因？ 位点为tsr内的EcoRV。当外源基因插入EcoRV位点时，硫链丝菌素基因失活。利用新霉素来筛选重组子。 第4页/共121页怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去? 化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。 第5页/共121页列举两种外源基因转化的方法?如何提高其转化效率?CaCl2处理后的细菌转化或转染：低温和CaCl2处理制备感受态细胞，使细胞膜通透性增加，处于容易捕捉和接受外源DNA 的状态。电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 质粒的大小，拷贝数；受体细胞的状态；转化的外在条件，如温度等;质粒与宿主菌的比例。 第6页/共121页建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?第7页/共121页1 基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。诱导型启动子：如lac、trp、λPR、 λPL、 tac等的启动子原核生物启动子组成型启动子：如T7噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。第8页/共121页mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。第9页/共121页外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。第10页/共121页不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（major codon）罕用密码子（rare codon）如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。第11页/共121页1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统第12页/共121页1.5 目的基因沉默位置效应的基因沉默：是指基因在基因组中的位置对其表达的影响基因沉默的作用机制转录水平的基因沉默：是在DNA水平上的基因调控转录后水平的基因沉默：是在RNA水平上的基因调控第13页/共121页第七章 克隆基因的表达基因激活转录起始mRNA水平蛋白质水平第14页/共121页克隆基因的表达第一节 基因表达的基本过程第二节 外源基因在原核细胞中的表达第三节 外源基因在真核细胞中的表达第四节 提高外源基因表达效率的途径第15页/共121页第一节 基因表达的基本过程　基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。第16页/共121页基因表达的基本过程第17页/共121页基因表达的基本过程 基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。 首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA, messenger RNA )； 然后， tRNA （转运RNA, transfer RNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将