分子生物学载体.pptxVIP

第1页/共94页分子生物学载体第2页/共94页 载体 （Vectors）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。载体是DNA双链分子。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可转入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA共同扩增。第3页/共94页载体的功能1. 为外源基因提供转入受体细胞的转移能力；2. 为外源基因提供在受体细胞中的复制或整合能力；3. 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达提供必要的条件能力。第4页/共94页理想载体至少必备的条件① 能在宿主细胞中自主复制② 容易进入宿主细胞③ 容易插入外来核酸片段④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作⑤ 具有合适的筛选标记⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 （可转移性）第5页/共94页目前的主要载体 质粒（Plasmid） 单链DNA噬菌体M13 ?噬菌体的衍生物 柯斯质粒（Cosmid） 动物病毒（virus） 细菌人工染色体(BAC) 酵母人工染色体(YAC) 第6页/共94页第7页/共94页大肠杆菌的质粒第8页/共94页质粒（plasmid） 独立于染色体以外的能自主复制、并能被稳定遗 传的一类双链闭合环状DNA分子。 存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 分子量： 1--300 kb。 编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。如： 抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的 特性（非必须）。 环形状：双链环状DNA。 第9页/共94页质粒DNA的空间构型? SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形 结构，DNA呈现超螺旋。? OC构型:两条链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现缺口，称之 为开环DNA。? L 构型: DNA双链均发生断裂而形成线性分 子。第10页/共94页OCLSC? 质粒空间构型与电泳速率 分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。第11页/共94页1.1 质粒的生物学基本特性 1. 自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。第12页/共94页质粒的生物学基本特性2. 生物不相容性（ Incompatibility ）有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。同群质粒含有相似复制子结构的不同质粒。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容第13页/共94页质粒的不相容性分子机制两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。第14页/共94页质粒的生物学基本特性3.可转移性 部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。4.稳定性 质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。5.寄生性 质粒只能在宿主的细胞内复制。6.可扩增性第15页/共94页质粒的生物学基本特性7. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。第16页/共94页1.2 质粒的类型（1）按转移性分 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom 和mob 基因决定。第17页/共94页1.2 质粒的类型（2）按复制机理分：严紧控制型质粒，松弛控制型质粒。 严紧型复制质粒（stringent plasmid）严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复制随细菌染色体的复制同步进行。特点：拷贝数少，只有1 - 3 拷贝（接合型质粒分子量大， 一般属严紧型）。 松弛型复制质粒（relaxed plasmid）松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合