实验三_单向琼脂扩散实验.docxVIP

临床免疫学实验指导 检验医学院免疫学教研室 吴荣泉▲导恣片整軽■地!￡擊女St物手戏內触材 免疫学实验 淄◎ ◎ ? 。 ◎ o ；◎◎。 羊向柯卄4*您疫扩散 实验二、单向琼脂扩散试验 【实验原理】 III将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中 加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在 比例适宜时形成白色沉淀环.沉淀环直径与抗原含量成正比。 用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准 曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗 原的含量。 III 本试验主要用于检测标本中各种lg、补体的含量等，具有高灵 敏性，高特异性特点。 【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用 【试剂与器材】 1.2.3.4.Illi用于制作标准曲线羊抗人IgG 1. 2. 3. 4. Illi 用于制作标准曲线 pH7. 4 0. 01M PBS缓冲液（或NS ） 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液） ||载玻片、打孔器、37°C恒温箱、湿盒、 || 可调微量加样器等 【操作注意事项】 1? 1?制备抗体琼脂板琼脂温度必须严格控制，温度 11/ 太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边 缘，确保每孔的液面基本一致 加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头 检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作 孵育时间应控制在37°C, 24-48小时，时间太短 或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。 【标准曲线的制备】由实验教师 购买标准已知浓度的 人血清（IgG—抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人）抗人IgG—抗体（抗血清） 制备1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉1. Og,加NS, lOOnil.混匀加热溶解成透明液体， 56°C,加入标准抗血清1. 0—1. 5ml,混匀，制板 制板，打孔，孔径3tmn,孔距1. 2T. 5cm,打5个孔。 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10卩L 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160. 稀释 100 mg , 50mg , 25mg , 12. 5mg , 6. 25mg. 浓度 保温反应：将凝胶板放湿盒内，37C反应24h,观察结果. 用坐标纸制作标准曲线：以沉淀环直径（m m）为纵坐标； 以标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线. 3. 4. 5. 6. III 111 II 标准曲线与样品测定结果（实物实拍） ①30 ④15 皿ID m m ? 标准曲线制备：标准抗原稀释4钟浓度，预温24h,沉淀环直径数据 .711 ②25 ③20 测定样本：病人血清（标本1. 25mm,标本2. 20mm ） III 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。 F/N 沉淀环直径(毫米) .r t ‘I I?rrrrrrrrrr任 LLL 一LL rrrr rrr r rrrr EEEE LLLL LLUL rrrr rrrr rrrr EEE LLLL LLLL uulu rrrxtuu rrrcLLLL ■ rrrr rrrr ?「「「 母 -ljZll .二 LL ^JLL LL LUU u uu H Hr A AA rrr rrr rrr rrr rrr r r rr btr LL LU L L n uuuu uu uu L A LULL UUUU LL LL L A AAl LLL L Lt- lL LLLL rrrr rrrr rrr rrn rrz 匕一 L L_L J-L UL UU uu uu rrrr rrrr rrrr rrrrrrrr rrrr rrrr rrrr 矩 LLLL LLLL LLUu rrrr- rrrr rrrr LULL tbtt ULL U L UU L. uuu u uu u UUU u uuu u rrr rr rr rrrr +tE LLLL LULL LL LU uuuu a ala rrrr rrrr rrrr FEE LLLL LLLL LL L L rrrr rrrr rrrr 压 LLLL ULLL ULL L UL.LC uuuu uuuu all a AA A A rrrr rrrr LLLL rrrr rrrr LLLL r r rr r r rr rrrr rrrr HKKF HKKk A AA A r*rr r , ，，, LLLL r r r r rrrr rrrr rrrr rr r r rrrr rrrr rrr r rrr