分子生物学与基因工程课件-第九章 转入与筛选.pptxVIP

第九章 转入与筛选;转化：transfermation，通过生物学或理化方法使以质粒DNA为载体构建的重组/非重组DNA导入受体细胞的过程。 转染：transfection，以病毒/噬菌体载体DNA为基础构建的重组/非重组DNA，未包装直接导入受体细胞的过程。 转导：transduction，以病毒/噬菌体载体DNA为基础构建的重组/非重组DNA，经包装后导入受体细胞的过程。 ;1. 直接转化法; 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇（DTT）等处理制备感受态细胞。 ; 感受态细胞的制取一般是将细菌（如大肠杆菌等）用一定浓度的冰冷CaCl2处理而得。 1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，便于外源DNA导入受体细胞。 ;直接转化法的操作程序： 1）处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞磷脂层形成液晶结构，使得外膜与内膜间隙的部分核酸酶离开所在区域，构成大肠杆菌人工诱导的感受态； 2）加入DNA，Ca2+与DNA形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜外表面； 3）经短暂42℃热激处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，出现许多间隙，导致通透性增加，DNA分子进入细胞中。;;2. 化合物诱导转化法;3. 高压电穿孔转化法 ;例如：高压电穿孔法转化细菌;4. 微弹轰击转化法;适用范围：植物细胞 特点：操作简单、转化率高、耗资较大;5. 显微注射法;过程（动物细胞为例）：将外源基因直接注入实验动物受精卵原核，外源基因整合到动物基因组，通过胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受体子宫并发育。 适用范围：真核生物，早期用于动物，现已应用于植物。 特点：繁琐耗时、转化率高，但需专门的显微注射仪，且要求操作者有精细的操作技术和低密度细胞培养技术。;6. 脂质体介导法;7. 花粉管通道法;8. 超声波介导转化法;9. 激光微束穿孔转化法 ;;10. 病毒颗粒转导法;11. 磷酸钙转染???;12. DEAE-葡聚糖转染法;13. 聚阳离子-DMSO转染法;14. 农杆菌介导Ti质粒载体转化法;15. 胚囊、子房注射法;载体遗传标记检测; 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 含有外源DNA的受体细胞称为转化子；含有重组DNA的转化子称为重组子；含有目的基因的重组子称为目的重组子或期望重组子。;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;克隆DNA序列检测;;克隆DNA序列检测 DNA序列分析法;外源基因产物检测;外源基因产物检测;外源基因产物检测;外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法;外源基因产物检测 蛋白质生物结构鉴定法;外源基因产物检测