基因工程课件-第六章 酵母基因工程.pptxVIP

酵母基因工程;1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测序 （共有17条染色体,基因组全序列已于1996年测定,大小为12.052Mb,共6500个基因）。;（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征; 如果说E.coli是外源基因最成熟的原核生物表达系统，Yeast则是最成熟的真核生物表达系统。;酵母菌表达外源基因的优势：;酿酒酵母基因组特征; 表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。;（二）酵母菌的宿主系统;1、用作模式真核生物的酵母宿主菌;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：;巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha);乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe); 酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。;3、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌;4、抑制超糖基化的突变宿主菌; 抑制超糖基化的突变类型;5、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌;泛素降解途径衰减的酿酒酵母;UBA1缺陷型：;UBC4-UBC5双突变型： ;（三） 酵母菌的载体系统;含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；;酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 信号肽 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建;酵母菌种的野生型质粒;2u质粒;该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A与B两种形态中转化，REP1、REP2、D基因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编码基因．上述基因共转录出7种不同分子量的mRNA分子。 ;在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决定： 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝均分给母细胞和子细胞. 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝数水平。 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得高拷贝的主要机制。;酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其既可以在酵母中??制，又可以在大肠杆菌中复制。;YEp质粒：;酵母复制型质粒（YRp）来源于大肠杆菌质粒pBR322。同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。;特点： 转化率高（102-103转化子/微克DNA) ，可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。但不稳定，容易丢失。;;酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞中的拷贝数很低。 但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十分缓慢，而且细胞的生存能力下降。;酵母菌克隆表达质粒的构建;YCp质粒：;酵母菌克隆表达质粒的构建;YAC质粒：;整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因得到稳定表达。 在啤酒酵母中含有30～40个拷贝的可转移的遗传因子(Ty),其结构包括两个长OFR和两个长末端重复序列(LTR) , Ty可以整合到宿主细胞的染色体上。如果在Ty的OFR2的3端与LTR的3端之间插入外源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵母染色体上。;YIp质粒：;（四）酵母菌的转化系统;酵母菌的转化方法;原生质体转化法;原生质体转化法的缺点：;2）碱金属离子介导转化法;3）电击转化法;转化质粒在酵母细胞中的命运;3）不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对体内定点突变酵母基因组极有利。;用于转化子筛选的标记基因;宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-;显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。;利用质粒上的营养成分生物合成标记基因互补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不添加任何筛选试剂的条件下维持转化子中质粒的存在，但这种筛选互补模式并不稳定，而且对选择培养基的要求也很高，在大规模传统发酵中普遍使用的复合培养基一般不能用作这种转化菌的培养。;近年来发展起来的自选择系统是克服上述困难的的一