第14章基因重组和基因工程.pptVIP

乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验） 第九十二页，共一百一十九页。 诱导物 Z Y X P O Z Y X P O 乳糖 第九十三页，共一百一十九页。 标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 lacZ 第九十四页，共一百一十九页。 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal α互补（蓝白筛选） 第九十五页，共一百一十九页。 （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 第九十六页，共一百一十九页。 Southern印迹 （3）分子杂交法 第九十七页，共一百一十九页。 原位杂交 当溶液中的DNA分子经高温或高pH处理后，DNA双链分子变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或pH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性——分子杂交。 第九十八页，共一百一十九页。 * 原位杂交技术 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 第九十九页，共一百一十九页。 名　　称　　 　识别序列及切割位点 名　　称　　　　　识别序列及切割点 切割后产生５’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’ 切割后产生3’突出末端: Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’ 限制性内切核酸酶 第六十页，共一百一十九页。 （三）目的基因 研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。 你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。 基因组DNA (genomic DNA) cDNA (complementary DNA) 第六十一页，共一百一十九页。 （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 分子运输车 第六十二页，共一百一十九页。 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 第六十三页，共一百一十九页。 载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源