细胞融合及其应用.pptxVIP

细胞融合及其应用;第四章 细胞融合及其应用;;;;;;;;什么是细胞融合？ 为什么要进行细胞融合？ 简述细胞融合的研究历史。;一、细胞融合的概念和意义;克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。 如：薯番茄、番茄薯 ;;; 1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出马铃薯的块茎。 后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”，据说番茄的产量很高。; 创造细胞质杂种;为遗传学研究提供新的手段。 如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的发生等。 ;;二、基本原理;1.相关概念： 合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。 同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。 异核体（heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。 杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种。;2.基本原理;;三、细胞融合方法;1.1植物或微生物原生质体的制备 1.2动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质丰富的纤维组织、癌组织等。; ;;2.1.2 高钙-高pH法：; PEG是一种多聚化合物，分子量在200－20000之间，毒性小易操作。 用PEG法与高钙-高pH法结合:制备两亲本的原生质体，并至合适密度（105个/ml）；将PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃，10－20分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液15分钟；洗涤，收集细胞计算融合率。 融合促进剂:伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜??链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。;PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连; 在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合; 高Ca2+高pH清洗增加了质膜的流动性，大大提高了融合频率。;;;;;;;;;;;;电融合 原理：细胞处于不均一的交变电场，细胞极化成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,融合频率达60%） 。 优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。 ;;;;;仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。 １９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起； 不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。;;;优点： 融合效率高，适合于各种动物细胞； 仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。 缺点: 仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰；;;;3.1植物细胞融合： 植物原生质体融合无种属特异性，融合效率只与外界条件有关。 PEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；PEG的规格和纯度，分子量多为4000－6000。 电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2×104－8 × 104 电融合时，加入少量CaCl2,可维持电导率，保护细胞；交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。 添加促融合剂，可提高融合率。;3.2 动物细胞融合 亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容易；表面光滑的不易融合； 细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞或血球细胞不易融合。 融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，37度、振荡。 需氧量大，缺氧常不融合。 需要