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实验二 鸡新城疫弱毒疫苗的制备 新城疫又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触 性传染病，其主要特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱及黏膜和浆膜出 血，一年四季均可发生，为我国养鸡业的头号疾病。预防和治疗所用 的新城疫疫苗种类很多，大致包括灭活疫苗和弱毒疫苗两类。下面以 新城疫弱毒疫苗为例讲述其制备过程。 一、目的与要求 1．掌握鸡新城疫弱毒疫苗的制备方法。 ．熟悉鸡新城疫弱毒疫苗制备的操作过程。2 二、材料与试剂 材料：种蛋、鸡胚孵化箱、冰箱、无菌操作台、手术镊子、注射 器、蜡烛、酒精灯、酒精棉和碘酊等。 试剂：灭菌PBS液/生理盐水；青、链霉素溶液。 三、制备前准备 1、种毒的选择：种毒属于弱毒力毒株，包括HB1株、F株、LaSota 株、LaSota-Clone30和N79株。必须符合：①种毒对鸡胚的毒力。 以10倍稀释的种毒0.1ml尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚应于接种后 24-120h内死亡70%以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上， 胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上。②种毒对1月龄雏鸡滴鼻 -3 免疫的最小免疫量应不大于10/1滴。③种毒对10日龄鸡胚半数感 -7 染量（EID）应不大于10/0.1ml。④种毒对初生雏鸡不致病。 50 -4 -6 2、种毒的稀释：用灭菌PBS液或0.85%生理盐水10～10稀释种 毒，稀释时最好加入适当双抗溶液，并在4℃作用约4小时。 3、鸡胚的选择：最好选用SPF胚、其次选用非免疫胚，再次选用 普通胚。 四、操作过程 1、将购买的种蛋放于37℃温箱中孵育，加入适量水调节湿度。 2、孵育至9～11日龄时，将鸡胚置于黑暗的环境下，在照蛋器下， 可观察到明显的胚体运动、丰富的血管和气室，用铅笔划出接种部位 和气室部位。划线时要尽量避开胚头和血管（尤其是大血管）。 3、将划好的鸡胚置于经紫外线消毒过的超净台中，先用碘酊消毒， 再用酒精棉脱碘； 4、用手术镊子在标记部位打孔，打孔时要在接种部位和气室各打 一孔。 5、用灭菌注射器吸取0.1ml～0.2ml稀释病毒液，经接种孔注入鸡 胚尿囊腔中； 6、用石蜡先将接种孔封口后，在将气室孔封口； 7、做好标记（时间，名称），置37℃温箱中继续孵育，增殖病毒。 8、接种后24小时内死亡的鸡胚作细菌污染处理，弃去；96h～120h 内死亡胚或120h内仍活着的鸡胚置4℃冰箱4-24小时，使鸡胚血管 收缩。 9、将接种病毒鸡胚先用碘酊消毒，再用酒精棉脱碘，用镊子打破 气室部位蛋壳，再用灭菌过的吸管收取尿囊液于灭菌瓶中。尿囊液里 应含有大量的弱毒病毒。 10、加入5%蔗糖脱脂乳分装、冻干制备成冻干疫苗。 五、质量检验 1．安全检验：下列方法任选其一。 用鸡胚检验 将疫苗10倍稀释，尿囊腔接种0.1ml10日龄鸡胚 10只，接种后24-72小时内鸡胚死亡率不超过20%为合格，若两次检 验结果均在接种后48h内全部死亡，并确定是由于接种物引起，则判 为不安全，不得用雏鸡再检，疫苗应予报废。 用鸡检验 用确无母源抗体的2-7日龄雏鸡20只 ，分成两组， 第1组10只，每只鼻孔内滴入10个使用剂量疫苗（约0.05ml）， 第2组10只作为对照。两组在同样条件下分开饲养观察10d，应无 不良反应。每组死亡的鸡雏均须尸体剖检及细菌检查，任何一组非特 异性死亡鸡不得超过1只。 2．效力检验：下列方法任选其一。 用鸡检验 用1-2月龄健康鸡10只（不含母源抗体或无ND血 凝抑制抗体），每只鼻孔滴入1/100使用剂量，10-14d后与另3只对 4 照鸡同时肌肉注射ND强毒10ELD，观察10-14d，对照鸡应全部 50 发病死亡，免疫鸡至少9只全部健活，疫苗判为合格，否则重检1次。 -6 -7 -8 用鸡胚检验 将10、10、10稀释的疫苗分3组接种10日龄 非免