抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点兰.pptxVIP

抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点兰;抗生素微生物检定法;1．抗生素微生物检定法的概况 ;1．2．微生物检定方法 1．2．1. 概述 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下的原因，抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取代微生物检定法： ;（1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点； （2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和活性的关系； （3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性； （4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本低。;1．2．2．抗生素微生物检定法分类 抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。 目前各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。?;1．2．3. 抗生素微生物检定方法比较：;2．微生物效价测定法国内外药典的比较;3．微生物效价测定法的操作要点 ;3.1.1．原理： 利用抗生素在摊布待定试验菌的琼脂培养基中扩散，形成一定浓度的含抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈的面积或直径成正比。;管碟法的基本公式;将上述公式简化、移行，并将自然对数转换为常用对数得： 上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质的量。 ;量－反应平行线原理： ;3.1.2．检定的影响因素： ;（1）标准品和供试品内在质量的不同所致。如多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性物质的量与供试品有所不同，可使量－反应平行线不平行。 （2）用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲液pH、盐浓度的差异。 （3）供试品制剂中含有维生素、氨基酸、无机盐及糖类等生长物质，导致在低营养条件的培养基上影响细菌的生长速率。 （4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供试品与标准品不同质。 （5）操作上可能引入的误差。;3.1.2.2．抑菌圈质量的控制 （1） 抑菌圈的形状： 实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现象，其原因是多方面的: 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等； 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染； 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定菌烫死等； 稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。 ;（2） 抑菌圈大小的控制 抗生素抑菌圈大小受浓度、加样量、最低抑菌浓度、扩散系数、扩散时间、培养基的厚度的影响 当抗生素浓度不变时，加样量的对数与抑菌圈直径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体积应一致。钢管（截面积，高度）的大小（重量、直径、高度）应严格控制。 抑菌圈大小受抗生素扩散时间的影响，故预先延长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。 ; 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以减少误差。 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力，使抑菌圈增大。 ;（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制 抑菌圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一，导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下： 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散系统交叉所致。 如试验菌种放置时间过长，菌群中个体的生长周期不同，对抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成双圈或多圈，使边缘模糊不清。 培养基原材料的成分及质量、pH值、盐浓度及培养时间均可影响抑菌圈边缘的清晰度。 ;3.1.2.3． 斜率的控制 由公式中斜率（ 1/ 9.21 DT） 来推算： 如扩散快，即扩散系数D值大，则斜率小；如细菌生长慢，时间长，T值大，则斜率小。反应直线的斜率愈小愈好，因为斜率越小，直线越平稳，抗生素效价的微弱差别，可导致抑菌圈大小的差别较大，使测定结果更精确。 如扩散系数D值不变，T值变小，则试验菌生长快，时间短，斜率就大，这样生物反应的灵敏度低，重现性差。为使T值增大，可在滴加药液后，在室温放置约1小时，再置孵箱培养。 ;3.1.