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生化大实验的学习课件;《生化大实验》;实验课程简介;目 录;实验一 蛋白质含量的测定; 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。 ;【实验仪器及用品】;6. 移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2）， 5ml（×1）7. 分光光度计8. 试管1.5cm×15cm (×8)9. 量筒100ml(×1)10. 电子分析天平11. 试管架(×1) ;【实验内容及步骤】;2. 未知样液的测定  另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】 1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。;【思考题】;二、紫外分光光度法测定蛋白质含量; 利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。;【仪器与试剂】 1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。 2. 标准蛋白质溶液：0.9%?NaCl溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。 3. 待测蛋白溶液：用酪蛋白配??，浓度在1.0-2.5mg/ml 4. 0.9%?NaCl溶液 5. 试管1.5cm×15cm（×9） 6. 移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml（×2）。;【实验步骤】 1、标准曲线法 （1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。; （2）样品测定：? 配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 2. 直接测定法 在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260? (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。; 本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。【注意事项】 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题】 1.?紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？ ;三、Folin-酚法测定蛋白质浓度;【材料、试剂、与器具】;3、标准浓度牛血清蛋白溶液200μg/ ml4、721分光光度计5、刻度吸管0.5ml（×1），1ml（×2），5ml（×1）6、试管1.5cmX15cm8只7、恒温水浴【操作步骤】1、标准曲线的绘制; 取6只试管，按下表加入试剂:; 加入试剂A后，混匀，室温10min，在加Folin-酚B 3.0ml，混匀后10min，再第二次加0.2ml