PCR基因扩增及扩增产物的回收.pptxVIP

PCR基因扩增及扩增产物的回收;主要内容;目的产物 ;目的基因AKP的扩增－PCR;;PCR的种类;PCR技术原理;DNA模板高温变性: 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA;;;1. Taq DNA聚合酶;无3’? 5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA;2. 引物设计的总原则：  扩增的效率和特异性;5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列 ;Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2Tm= 81.5+16.6(lg[K+])+0.41(%[G+C])-675/n;模板的量：不能太多，100?l反应体系中约100ng; dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称，一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L，浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率 ;;关于本次实验;大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因序列（CDS，1.5Kb） 551 aagttgtcac ggccgagact tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt 601 atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca aagcactatt gcactggcac 651 tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcccggac accagaaatg 701 cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagggc gatattactg cacccggcgg 751 tgctcgccgt ttaacgggtg atcagactgc cgctctgcgt gattctctta 801 gcgataaacc tgcaaaaaat attattttgc tgattggcga tgggatgggg 851 gactcggaaa ttactgccgc acgtaattat gccgaaggtg cgggcggctt 901 ttttaaaggt atagatgcct taccgcttac cgggcaatac actcactatg 951 cgctgaataa aaaaaccggc aaaccggact acgtcaccga ctcggctgca 1001 tcagcaaccg cctggtcaac cggtgtcaaa acctataacg gcgcgctggg 1051 cgtcgatatt cacgaaaaag atcacccaac gattctggaa atggcaaaag 1101 ccgcaggtct ggcgaccggt aacgtttcta ccgcagagtt gcaggatgcc 1151 acgcccgctg cgctggtggc acatgtgacc tcgcgcaaat gctacggtcc ;1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa 1251 aaggatcgat taccgaacag ctgcttaacg ctcgtgccga cgttacgctt 1301 ggcggcggcg caaaaacctt tgctgaaacg gcaaccgctg gtgaatggca 1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac aggcacaggc gcgtggttat cagttggtga 1401 gcgatgctgc ctcactgaat tcggtgacgg aagcgaatca gcaaaaaccc 1451 ctgcttggcc tgtttgctga cggcaatatg ccagtgcgct ggctaggacc 1501 gaaagcaacg taccatggca atatcgataa gcccgcagtc acctgtacgc 1551 caaatccgca acgtaatgac agtgtaccaa ccctggcgca gatgaccgac 1601 aaagccattg aattgttgag taaaaatgag aaaggctttt tcctgcaagt 1651 tgaaggtgcg tcaatcgata aacaggatca tgctgcgaat ccttgtgggc 1701 aaattggcga gacggtcgat ct