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血液分子生物学细胞培养技术第1页/共67页第2页/共67页显微技术 根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源。电子显微镜以电子束为光源。第3页/共67页—、光学显微镜（一）普通光学显微镜第4页/共67页（二）荧光显微镜 细胞中有些物质，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。第5页/共67页荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.? 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.? 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.? 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光， 目镜和物镜之间的用于滤 除紫外线，用以保护人目。第6页/共67页荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 第7页/共67页（三）激光共聚焦扫描显微境? 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，ICSM）用激 光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。? 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚 焦点，也是瞬时成像的物点。? 由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较 高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。? 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。? 调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图 像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样 品的立体结构。第8页/共67页激光共聚焦扫描显微镜 观察细胞形态 细胞内生化成分的定量 分析 光密度统计以及细胞形 态的测量 LCSM照片蓝色为细胞核绿色为微管 第9页/共67页（四）倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒。倒置显微镜的物镜在载物台之下。用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。第10页/共67页二、电子显微镜（一）透射电子显微镜第11页/共67页1. 基本原理★ 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微 结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。★ 要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。★ 1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。第12页/共67页★ 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本 一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。★ 由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制 成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄 切片机（ultramicrotome）制作。★ 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。★ 电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录 系统、电源 系统等5部分构成。第13页/共67页2. 制样技术1）超薄切片通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片， 切片厚度20~50nm， 切片采用重金属盐 染色，以增大反差。第14页/共67页2）负染技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 肌动蛋白纤维的负染电镜照片 第15页/共67页 3）冰冻蚀刻? 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。? 用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。? 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90度角 喷涂一层碳，加强反差和强度。? 用次氯酸钠溶液消化样品，把 碳和铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。 ? 复膜显示出标本蚀刻面的形态， 在电镜下得到的影像即代表标 本中细胞断裂面处的结构。第16页/共67页（二）扫描电子显微镜★ 扫描电子显微镜（scanning electron microscope）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。★ 其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本