成信工环境工程微生物学实验指导02微生物的染色技术.docVIP

PAGE 22 PAGE 21 PAGE 1 实验二 微生物的染色技术 一、实验目的 （一）了解微生物的染色原理。 （二）学习微生物涂片染色操作技术。 （三）掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。 二、染色原理 微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。 革兰氏染色法（复染色法或鉴别染色法） 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。此处介绍革兰氏染色法。 革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法，它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。革兰染色结果是由细菌的细胞壁决定的。革兰阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽聚糖层网孔变小，其通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内，经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色（紫色）；后者用酒精脱色时，类脂质被酒精溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物易被抽取出来，紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复剂的颜色（红色）。革兰染色最关键的步骤是酒精脱色。事实上，用结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。碘是一种媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，以增强染料与细菌的结合力。只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。 三、实验仪器、材料 （一）显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯（或煤气灯）。 （二）石炭酸复红（品红）染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液 （三）菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、活性污泥等 四、实验内容和步骤 革兰氏染色步骤（图4） 1．取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。方法均与简单染色的相同。 2．初染 用草酸铵结晶紫染液染1min，水洗。 3．媒染 加革氏碘液媒染1min，水洗。 4．酒精脱色 斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30 s至45 s，水洗。） 染色关键：必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。 5．复染 用蕃红染液复染1 min，水洗。染色结果见图5。 6．镜检 用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。 （a）加结晶紫染1min；（b）水洗；（c）加碘液媒染1min；（d）水洗； （e）酒精脱色；（f）水洗；（g）番红染液复染2min；（h）水洗； （i）用吸水纸吸干 图4 革兰氏染色过程 G+紫色，为革兰氏阳性菌，G-红色，为革兰氏阴性菌 图5 革兰氏染色结果 五、实验报告内容 1、微生物的染色原理是什么? 2、写出革兰氏染色的步骤和注意事项 3、绘出菌体形态，并给出革兰染色结果。 思考题 1、革兰氏染色法中若只做1～4的步骤而不用蕃红染液复染，能否区分G+菌和G-菌？为什么? 2、微生物经固定后是死的还是活的？ 3、通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？