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实验三 培养基的制备和灭菌技术
一、实验目的
(一)熟悉灭菌前的准备工作。
(二)掌握培养基和无菌水的制备方法。
(三)掌握高压蒸气灭菌技术。
二、实验仪器、材料
(一)培养皿(直径90 mm)10套,试管(15 mm×150 mm)5支,(18 mm×180mm)5支,移液管(10 mL)1支,(1 mL)2支,锥形瓶(250 mL)2个,烧杯(500 mL)1个,玻棒2支,玻璃珠30粒。
(二)纱布、棉花、牛皮纸(或报纸)。
(三)精密pH试纸6.4~8.4、10%HCl、10%NaOH。
(四)牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、或市售营养琼脂培养基、蒸馏水。
(五)高压蒸气灭菌锅、烘箱、煤气灯或酒精灯。
三、实验内容
(一)玻璃器皿的洗涤和包装
1.洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡,再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。
2.包装
(1)移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成l~1.5 cm长的棉塞(以防细菌吸入口中,并避免将口中细菌吹人管内)。棉塞要塞得松紧适宜,吸时既能通气,又不致使棉花滑人管内。将塞好棉花的移液管的尖端,放在4~5 cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30°夹角,折叠包装纸包住移液管的尖端(图7A),用左手将移液管压紧,在桌面上向前搓转,纸条螺旋式地包在移液管外面,余下纸头折叠打结。按实验需要,可单支包装或多支包装,待灭菌。
(2)用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住
棉塞的制作:按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量,将棉花铺成中心厚,周围逐渐变薄的圆形,对折后卷成卷,一手握粗端,将细端塞入试管或锥形瓶的口内,棉塞不宜过松或过紧,用手提棉塞,以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁,不能有皱折,以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3,其余留在管口(或瓶口)外,便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后,用牛皮纸包并用细绳或橡皮筋捆扎好(图8B)放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。
(3)培养皿由一底一盖组成一套,用牛皮纸或报纸将10套培养皿(皿底朝里,皿盖朝外,5套、5套相对)包好。
(二)制备培养基的一般过程
图7 A. 移液管B.试管、锥形瓶c.培养皿
培养基是微生物的繁殖基地。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养物配制而成。其中含水分、碳化合物、氮化合物、无机盐等,这些营养物可提供微生物碳源、能源、氮源等,组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同,或培养不同种类微生物可配成各种培养基。通常培养细菌是用肉膏蛋白胨培养基,培养放线菌常用淀粉培养基,用豆芽汁培养霉菌,用麦芽汁培养酵母菌。
培养微生物除了满足它们各自营养物要求外,还要给予适宜的pH、渗透压和温度等。
根据研究目的的不同,可配制成固体、半固体和液体的培养基。固体培养基的成分与液体相同,仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入15g/L~30g/L的琼脂为固体培养基;加入3g/L~5/L的琼脂为半固体培养基。有的细菌还需用明胶或硅胶。培养基的制备一般过程如下:
1.配制溶液
取一定容量的烧杯盛入定量蒸馏水,按培养基配方逐一称取各种成分,依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解,待全部溶解后,加水补足因加热蒸发的水量。注意:在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌,避免琼脂糊底烧焦。
2.调节pH
用精密pH试纸测培养基的pH,按pH的要求用质量浓度100g/LNaOH或体积百分数10%HCl调整至所需的pH。
3.过滤
用纱布或滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高,可不过滤。
4.分装
按图8-9所示,将培养基分装于试管中或锥形瓶中(注意防止培养基玷污管口或瓶口,避免浸湿棉塞引起杂菌污染),装入试管的培养基量视试管的大小及需要而定,一般制斜面培养基时,每支试管装的量为试管高度的,1/4~1/3。
图8 培养基的分装 图9置放成斜面的试管
5.斜面培养基的制作
将已灭菌的装有琼脂培养基的试管取出,趁热斜置在木棒(或橡皮管)上,使试管内的培养基斜面长度为试管长度的1/3~1/2之间,待培养基凝固后即成斜面(如图10。
(三)本实验用培养基的制备
肉膏蛋白胨琼脂培养基(供测定细菌总数用及细菌纯种分离培养用)。
1.培养基配方
牛肉膏1.5g,蛋白胨3.0g,氯化钠1.5g,琼脂6g,蒸馏水300 mL,pH=7.6
灭菌:1.05 kg/cm2,20 min。
2.操作
(1)取一个500 mL的烧杯,装300 mL蒸馏水。
(2)在药物天平上依次称取配方中各成分,放入水中溶解,待琼脂完全融化后停止
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