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第六章 凝胶层析;;Gel filtration chromatography;;对凝胶过滤介质的要求;凝胶特性参数 内水体积Vi：孔体积 外水体积Vo：颗粒间体积 柱床体积Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt′= Vi+Vo 洗脱体积Ve Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi ;A：“全排阻”， 流经体积Vo Kd=0 C：“全渗入”， 流经体积Vo+Vi Kd=1 B：“部分排阻”或 Ve=Vo+KdVi 0＜ Kd＜1 Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系数” 或“分配系数” 一定规格凝胶， Kd特征常数 ;Kd＞1 物质分子与凝胶之间有吸附 Tyr=1.4 G-25 小分子Kd＜1 水合作用 NaCl 0.8 G 0.9 整个凝胶作为固定相 Vi+Vg Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系数 分子形状不同M相近也可分开 牛血清白蛋白（球）、兔血红蛋白（棍） 68000d;凝胶特性参数;;;GFC的优点;GFC的不足之处;凝胶的结构和性质;;;规格编号 间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限 G-50 分离限1500-30000 G-150：5000-400000 对蛋白、多糖分离范围不同 （多糖分子体积比相同M的蛋白大） 粒度：直径100-300um粗粒 20-80um细粒 40-120um中粒;保存 湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5℃ 干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%） 脱水收缩，抽滤，60-80 ℃吹干，室温 半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4 ℃ ; 修饰葡聚糖凝胶 亲脂性 引入有机基团 Sephadex LH-20（羟丙基）（原Sephadex G-25） 流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂氯仿、四氢呋喃，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 交联葡聚糖离子交换剂 引入CM-，DEAE-，离子交换、 分子筛 ;;; 特点： 1.化学稳定性差，pH4-9 2.脱水、干燥、冷冻、有机溶剂、温度高于40℃便融化 3.与硼酸形成配合物，孔径变化，避免 4.强度低，随凝胶浓度↑而↑，弹性小，调整柱压 5.非特异性吸附力＜葡聚糖，I＞0.01mol/l无明显吸附 6.分离的M范围大（108），随凝胶浓度↑而↓ ;架桥琼脂糖凝胶 Sepharose CL 1，3-二溴丙醇交联，孔径均匀，孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但机械强度↑，热稳定性↑，化学稳定性↑（pH3-14） ;;多孔玻璃微珠;实验操作 凝胶介质的选择;凝胶介质的选择;粒度的选择 细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒： 用于粗制、脱盐 ;凝胶的预处理; 层析柱的选择 柱比：长度/直径、 体积 类分离： 柱床体积为样品体积5倍或略多 柱比5:1-10:1 分级分离：25-100倍 柱比25-100 大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高 ;实验室用的层析柱; 装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。 不能出现分层、倾斜、气泡 ;;凝胶柱的平衡;;; 洗脱 用水、缓冲液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸 温度、流速、柱压、阻力恒定 防止非特异性吸附 操作压↑流速快，峰宽 相当大柱压范围内 v=K△P/L 相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大 ;部分收集器;自动馏分收集仪（进口）; 再生 重复使用 流速下降、板结可反冲，取出漂洗;凝胶床的检查和维护 使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速↓ 控制操