实验动物 支原体荧光定量PCR检测方法标准文本.pdfVIP

实验动物 支原体荧光定量PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物支原体荧光定量PCR检测方法。 本文件适用于实验小鼠、大鼠及其饲养环境中支原体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 GB/T 14926.8 实验动物 支原体检测方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 39760 实验动物 安乐死指南 3 术语、定义和略缩语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光聚合酶链式反应 real-time PCR 在常规PCR 的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进 程，通过检测每次循环中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲线对 未知模板进行定性或定量分析。简称荧光定量PCR 。 3.1.2 Ct 值cycle threshold 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline) 1 4 基本原理 根据支原体基因保守区域设计合成一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告 荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶的5→3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光 信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过 检测荧光信号对核酸模板进行检测。 5 主要设备和材料 荧光定量PCR仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织匀 浆器、生物安全柜、超净工作台、超低温冰箱、微量移液器（0.2μL~2μL；2μL~20μL；20μL~200μL； 100μL~ 1000μL）、离心管（1.5mL ；5mL ；15mL ）、PCR管（0.2mL ）、吸头、无菌剪刀、镊子、灭菌 棉拭子、聚乙烯自封袋（使用前紫外灭菌 20min ）。 6 试剂 6.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682 的要求。 6.2 灭菌PBS （配制方法见附录A ） 6.3 DNA 抽提试剂盒 6.4 荧光定量PCR 试剂盒 7 检测步骤 7.1 生物安全措施 实验操作及处理按照GB 19489的规定，在二级生物安全实验室由具备相关资质的工作人员进行相 应操作。 7.2 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T 19495.2 中的要求执行。 7.3 采样及样品处理 取样要求按GB14922.2 的规定执行，采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴 一次性手套。 7.3.1 脏器组织 按照GB/T 39760 的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的鼻咽部组织、气管组织或肺脏，剪 取待检样本2.0 g于无菌15 mL离心管，加入4 mL灭菌PBS,使用电动匀浆器充分匀浆1 min～2 min ，然后 将组织悬液在4 ℃，3000 r/min离心10 min ，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。 7.3.2 支原体分离培养物 2 可以直接使用GB/T 14926.8 分离培养法中支原体半流体培养基的培养物作为检测样本，取适量样 本装于无菌1.5 mL离心管