实验动物 嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR检测方法标准文本.pdfVIP

实验动物 嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物嗜肺巴斯德杆菌的荧光定量PCR检测方法。 本文件适用于实验小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔和饲养环境中嗜肺巴斯德杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 GB/T 14926.12 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 39760 实验动物 安乐死指南 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光聚合酶链式反应realtime PCR 在常规PCR 的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时检测整个PCR 进程，通过检测每次循环中的荧光发射信号，间接反映了PCR 扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲 线对未知模板进行定性或定量分析。简称实时荧光PCR。 3.1.2 Ct 值 cycle threshold 实时荧光PCR 反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline) 1 4 基本原理 嗜肺巴斯德杆菌为革兰阴性小杆菌，主要寄居于龋齿类和兔类的上呼吸道。实时荧光定量PCR 方 法是在常规PCR 的基础上，加入了一条特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一 个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5 →3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生 并被检测仪器接受。随着PCR 反应的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧 光信号对核酸模板进行检测。 5 主要设备和材料 高压灭菌锅、荧光定量PCR 仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织 匀浆器、生物安全柜、超净工作台、超低温冰箱、微量移液器（0.2 μL~2 μL；2 μL~20 μL；20 μL~200 μL； 100 μL~1000 μL）、灭菌离心管 （0.2mL；1.5mL；5mL；15mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、 聚乙烯薄膜袋 （使用前紫外灭菌20min）、剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。 6 试剂 6.1 除另有规定外所用生化试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求 6.2 灭菌PBS溶液 （配制方法见附录A） 6.3 DNA 抽提试剂盒或其他等效产品 6.4 实时荧光PCR 试剂或其他等效产品 7 检测步骤 7.1 生物安全措施 实验操作及处理按照GB 19489的规定，在二级生物安全实验室内由具备相关资质的工作人员进行 相应操作。 7.2 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T 19495.2中的要求执行。 7.3 采样及标本处理 采样参照GB 14922.2中的要求执行，采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴 一次性手套。 7.3.1 脏器组织 按照GB/T 39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的鼻咽部组织、气管组织或肺脏，剪 取待检样本2.0g于无菌15mL离心管，加入4mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆1min～2min，然 后将组织悬液在4 ℃，3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。 7.3.2 嗜肺巴斯德杆菌分离培养物 2 可以直接使用GB/T 14926.12分离培养