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学士学位毕业答辩第1页/共16页 目 录前 言材 料 与 方 法结 果 与 分 析实 验 结 论东北农业大学1234第2页/共16页 前 言东北农业大学 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻璃珠破碎3种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋白质SDS电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法。第3页/共16页 实 验 材 料东北农业大学菌种设备无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜 、离心机、天平 、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、超声细胞破碎仪、pH计、微量进样器。试剂十二烷基硫酸钠、SDS低分子量标准蛋白、β-巯基乙醇、EDTA 、丙烯酰胺、30%丙烯酰胺溶液、甘氨酸、MRS培养基和蛋白质电泳储备液等。德氏乳杆菌保加利亚亚种(乳品科学教育部重点实验室提供)。 第4页/共16页 实 验 方 法东北农业大学保加利亚乳杆菌生长曲线的建立菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立无细胞提取物的制备超声破碎法：将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。离心，得到无细胞提取物。反复冻融法：将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后，离心取上清液备用。玻璃珠法：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高速涡旋振荡得到无细胞提取物。第5页/共16页 实 验 方 法东北农业大学细菌裂解程度观察涂片→晾干→固定→染色→水洗→煤染→脱色→复染蛋白质定量BCA试剂盒(碧云天)测定蛋白质浓度 ,根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。SDS蛋白电泳垂直平板电泳槽的安装→分离胶的制备→浓缩胶的制备→样品处理及加样→电泳→染色及脱色第6页/共16页 菌 株 活 化东北农业大学 11 % (w/v) 脱脂乳培养基，37℃，培养36 h后，凝固，革兰氏染色镜检观察结果(如图)，菌种纯，活力高，可用于下步实验。第7页/共16页 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 东北农业大学 保加利亚乳杆菌在MRS培养基中不同培养时间下的吸光值，并绘制其生长曲线。结果如图，保加利亚乳杆菌在5 h左右进入对数生长期，在12 h左右进入对数生长末期，16 h左右进入稳定期。第8页/共16页 细菌破碎程度分析 东北农业大学超声破碎法处理保加利亚乳杆菌 玻璃珠法处理保加利亚乳杆菌 反复冻融法处理保加利亚乳杆菌 镜下观察，玻璃珠法中细菌的破碎程度与超声破碎法相近，略低于超声破碎法。仍有少量杆状未被充分破碎。反复冻融法中细菌破碎程度明显低于玻璃珠法和超声法，有较多菌体仍然呈杆状未破碎，说明反复冻融法强度不够，不能使保加利亚乳杆菌充分破碎释放出蛋白质。 第9页/共16页 蛋白质标准曲线 东北农业大学第10页/共16页 蛋白质质量浓度测定 东北农业大学测定方法 超声破碎法 反复冻融法玻璃珠法BCA试剂盒法 1.730.220.67不同方法提取的保加利亚乳杆菌蛋白质质量浓度(μg/uL) 由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证了实验结果。第11页/共16页 蛋白质SDS图谱 东北农业大学用超声破碎法提取的3个平行细菌样本的蛋白质电泳图谱，由图可知，显示3个平行样本的蛋白质条带分部基本一致，重复电泳3次的谱图基本相同。第12页/共16页 蛋白质SDS图谱东北农业大学 3种方法提取的蛋白质条带分布和丰度有明显差异，超声破碎法和玻璃珠法提取蛋白质条带分布基本相同，但超声破碎法提取的蛋白质条带丰度明显较高，反复冻融法均最差。实验表明，超声破碎法的蛋白质提取方法最好。反复冻融玻璃珠超声法第13页/共16页 结 论东北农业大学细菌破碎程度 提取蛋白质质量浓度 蛋白质SDS结果 超声法可有效提取保加利亚乳杆菌蛋白质，具有较好的稳定性和重复性，且操作简单，不需要特殊的仪器。该方法的建立为进一步开展保加利亚乳杆菌蛋白质的研究奠定了基础，同时也为类似G+细菌的蛋白质提取提供参考。第14页/共16页 Thank You !第15页/共16页 感谢观看!第16页/共16页