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实验教学组织第1页/共54页第2页/共54页PCR特异性扩增DNA片段 第3页/共54页课标标准具体内容标准活动建议尝试PCR（ Polymerase Chain Reaction）技术的基本操作和应用用某一片段进行PCR扩增第4页/共54页实验目的 1、PCR技术扩增特异性DNA2、琼脂糖凝胶电泳检测第5页/共54页一、实验室准备二、实验准备三、教学组织第6页/共54页一、实验室准备1、PCR仪（1）美国MJ RESEARCH Minicycler （2）德国Eppendorf产品 一、实验室准备2、移液器第7页/共54页（1）德国Eppendorf（2）芬兰 Thermo Scientific Finnpipette第8页/共54页一、实验室准备3、灭菌锅第9页/共54页一、实验室准备4、离心机一、实验室准备5、电泳仪第10页/共54页北京六一仪器厂第11页/共54页川布兰公司第12页/共54页第13页/共54页第14页/共54页一、实验室准备二、实验准备三、教学组织第15页/共54页二、实验准备（课前）第16页/共54页（一）PCR准备工作1、人性别鉴定试剂盒（克隆Y染色体SRY基因）组成成分含量加ddH2O量ddH2O220μL\10Xbuffer+MgCl230μL\dNTP mixture7μL\引物Ⅰ0.1OD40μL引物Ⅱ0.1OD40μL Taq DNA聚合酶5μL\（1）在引物管中各加入40μL ddH2O，充分溶解 ，离心备用（2）4位同学一组，上课前15分钟，每个实验台上摆放好一个两面板（上面要摆上2个灭菌的0.2mL离心管），一个冰盒（含上表试剂），2支移液器，一盒灭菌10μL吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧杯），1记号笔。第17页/共54页4人一组的仪器和试剂2.学生操作第18页/共54页10Xbuffer 4μLdNTP mixture0.8μL引物Ⅰ 1μL引物Ⅱ 1μLddH2O12.6μLTaq DNA聚合酶 0.6μL 1uL12.4uL教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验3.PCR程序设计第19页/共54页 循环温度时间循环次数预变性94℃30s变性94℃20s25次退火52℃20s延伸72℃20s保温72℃30s第20页/共54页（二）电泳相关实验准备第21页/共54页（二）电泳相关实验准备第22页/共54页（二）电泳相关实验准备1、琼脂糖凝胶电泳试剂盒组成成分分装量琼脂糖4×0.25gDNA Marker30μL50×电泳缓冲液20mL核酸荧光染料80μL6×Loading Buffer80μL0.5mL的离心管1包（25个/包）（1）将50×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液（即20mL 50×电泳缓冲液中加入980mL 蒸馏水，稀释成1L的1×电泳缓冲液）第23页/共54页（2）制备2块胶备用第24页/共54页（3）将6×loading buffer和核酸荧光染料各取30μL，充分混匀，然后取24个0.2mL 离心管，每管分2μL的混合物，置于学生的两面板上备用第25页/共54页一、实验室准备二、实验准备三、教学组织（2节课时间）第26页/共54页三、教学组织（2节课时间）（一）第1节课1、PCR条件和原理（10min）2、移液器的使用（5min）3、配置反应体系（10min）4、PCR程序设计和反应5、教师将反应后体系-20℃保存第27页/共54页三、教学组织（2节课时间）（二）第2节课1、电泳原理（5min）2、胶的制备（5min）3、染色、点样（5min）4、电泳约20min—（继续按进度讲课或学生观摩）5、观察（下课前5min）第28页/共54页三、教学组织 （仅供参考）第29页/共54页问题1.体内DNA复制的条件？问题2.体内DNA复制的特点？第30页/共54页第31页/共54页问题3.如果只复制特定DNA片段（Gene2）呢？第32页/共54页一、PCR的原理和条件（10min）第33页/共54页(一)、PCR的原理和条件1.原理 变性 退火 延伸 第34页/共54页2.条件 模板DNA 引物（保证复制的精确起始） 4种脱氧核糖核苷三磷酸 DNA聚合酶第35页/共54页(二)、PCR实验操作第36页/共54页1.实验目的 PCR扩增人类性别决定基因SRY，并检测第37页/共54页2.实验材料和器具 2.1男生2根带有明显毛囊的头发 女生2根作对照第38页/共54页2.2 移液器、吸头、 离心管 第39页/共54页每取一种试剂更换枪头,每位同学尝试用移液器一次第40页/共54页 2.3 人性别鉴定试剂第41页/共54页3.配制反应体系（10min）BDS实验链接/01配制PCR反应体系.wmvA10Xbuffer 4μLdNTP mixture0.8μL引物Ⅰ 1μ