食品酶学本酶的分离纯化分离方法.pptxVIP

食品酶学本酶的分离纯化分离方法第1页/共41页 29 May 20232分离方法分述一、离心分离法二、过滤与膜分离三、沉淀分离法四、层析分离法五、电泳分离法六、酶的结晶七、浓缩与干燥第2页/共41页 29 May 20233四、层析分离法原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。第3页/共41页 29 May 20234（一）吸附层析法1、概念吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。图2、吸附剂硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗脱出来。3、吸附层析方法①吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；②把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加洗脱剂，使酶解吸而洗脱出来。4、特点与应用设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的层析分离技术。 枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，可吸附在氧化铝上，再用pH8～9的Na3PO3溶液洗脱；中性蛋白酶可在pH6.5～8.5条件下，用硅藻土吸附，再在pH9～11.5的2%氯化钠溶液中洗脱出来。第4页/共41页 29 May 20235吸附层析法图第5页/共41页 29 May 20236（二）离子交换层析1、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离。 2、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反离子。羧甲基纤维素（CM-纤维素）：纤维素-O-CH2-COO-Na 反离子 基质 电荷基团3、离子交换剂的种类4、离子交换剂的选择5、离子交换层析的操作流程6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、分辨率高、测定蛋白质的等电点。第6页/共41页 29 May 20237离子交换原理图第7页/共41页 29 May 202383、离子交换剂的种类基质电荷基团疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离小分子物质。大孔树脂可用于酶 。（离子交换树脂）亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。 （离子交换纤维素、离子交换凝胶）阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+），与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-），与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型常用的离子交换介（基）质 离子交换剂保存剂第8页/共41页 29 May 20239亲水性离子交换剂离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC（羧甲基纤维素）等。离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。 第9页/共41页 29 May 202310常用离子交换介质第10页/共41页 29 May 202311离子交换剂保存剂第11页/共41页 29 May 2023124、离子交换剂的选择强弱离子交换剂的选择： 强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。 弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。 酶蛋白的pI为6- 9时，考虑用强型离子交换剂。基质的选择： 分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性 酶在pH ＜pI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂； 酶在pH ＞pI的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂； 在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。 第12页/共41页 29 May 2023135、离子交换层析操作流程 ①离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析； ②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将