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DNA分子标记的资料第1页/共50页 RAPDRAPD random amplified polymorphic DNA Williams et al. 1990原理：随机扩增 引物：任意序列的10个碱基的寡核苷酸 片段 模板：未知序列的基因组DNA3/50第2页/共49页第2页/共50页 4/50第3页/共49页第3页/共50页 RAPD实验流程 DNA提取 PCR扩增 产物检测 数据记录 5/50第4页/共49页第4页/共50页 RAPD很难判断带的有无背景影响严重Ｑ：带的亮度差异很大？凝胶分辨率？6/50第5页/共49页第5页/共50页 RAPD7/50第6页/共49页第6页/共50页 RAPD阴性对照出带阳性对照 where8/50第7页/共49页第7页/共50页 RAPD反应体系BufferMg2+dNTPDNA 聚合酶引物DNAH2OMg2+浓度较高核酸外切酶活性较低单引物，序列短纯度，浓度纯度9/50第8页/共49页第8页/共50页 RAPD反应条件94℃36℃72 ℃ 引物退火温度太低 循环次数10/50第9页/共49页第9页/共50页 RAPD阴性对照阳性对照 可重复性11/50第10页/共49页第10页/共50页 RAPD数据记录 0 – 1矩阵 显性标记有有有有无50第11页/共49页第11页/共50页 RAPD缺陷 可重复性低 显性标记13/50第12页/共49页第12页/共50页 RAPDRAPD random amplified polymorphic DNA 10碱基 Williams et al. 1990AP-PCR arbitrary primer PCR 20, 30碱基 Welsh et al. 1990DAF DNA amplification fingerprinting 5, 8个碱基 Caetano-Anolles et al. 199114/50第13页/共49页第13页/共50页 随机扩增 RAPD, ISSR, 单核苷酸突变检验 SNP 限制性酶切 RFLP, PCR-RFLP, TRFP15/50第14页/共49页第14页/共50页 ISSRISSR inter-simple sequence repeat Zietkiewicz et al. 1994原理：随机扩增 引物：20bp左右 5’-BDB(ACA)5-3’16/50第15页/共49页第15页/共50页 17/50第16页/共49页第16页/共50页 ISSR50 mM of KCl, 1.5 mM of MgCl2, 0.25 mM of dNTPs, 2% formamide, 0.2 μM of primer, 0.5 mM of spermidine, 0.8 U of Taq DNA polymerase enzyme (Banglore Genei, India) and 20 ng of DNA per 25μl reaction Initial denaturation for 5 min at 94°C, each cycle comprised 1-min denaturation at 94°C, 45 s annealing at 49°C, 2-min extension at 72°C with a final extension for 5 min at 72°C at the end of 45 cycles. Most of the patterns with extremely good polymorphism and useful information were often accompanied with a background smear. To reduce this smear, 2% formamide was used in the reaction. All the patterns generated were repeated at least three times in order to obtain reproducible data.Joshi et al. 2000 Theor Appl Genet 100:131118/50第17页/共49页第17页/共50页 ISSR19/50第18页/共49页第18页/共50页 ISSR可重复性高于RAPD随机扩增显性标记20/50第19页/共49页第19页/共50页 SNPSNP single nucleotide polymorphisms 5’ – GGATCAGTACTGACTCAG – 3’ 5’ – GGATC