流式细胞术原理及应用.pptVIP

什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 为什么要进行补偿调节？ 520 400 500 600 700 575 665 FITC PE PC5 laser D、 单标对照 Single Staining Control 第三十一页，共五十七页，2022年，8月28日 第三十二页，共五十七页，2022年，8月28日 补偿调节方法： FL-1(FITC) FL-2(PE) FL-1(FITC) FL-2(PE) FL2 - %FL1 FL-1(FITC) FL-2(-) FL-1(-) FL-2(PE) FL1 - %FL2 Before Compensation After Compensation FITC 单标 PE 单标 第三十三页，共五十七页，2022年，8月28日 什么样的补偿最合适？ 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。 Uncompensated Compensated FL1-FITC stain FL2-no stain FL1-FITC stain PE-Medianneg PE-Medianpos PE-Medianneg= PE-Medianpos PE-Medianneg PE-Medianpos FL1-FITC stain Overcompensated 第三十四页，共五十七页，2022年，8月28日 准确补偿的重要性 第三十五页，共五十七页，2022年，8月28日 补偿调节要合适 未补偿 正确补偿 FITC-PE补偿太大 PE-FITC补偿太大 第三十六页，共五十七页，2022年，8月28日 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色 n色分析就要制备n 个补偿对照管 举例：双染实验 第三十七页，共五十七页，2022年，8月28日 设门与数据分析 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 第三十八页，共五十七页，2022年，8月28日 流式结果 十字门 线性门 第三十九页，共五十七页，2022年，8月28日 黏附因子 表面受体 细胞因子 分泌到胞外的细胞因子 胞内抗原 核酸含量 核内抗原 细胞功能 细胞表面、胞浆、核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 细胞受体 细胞内钙离子 流式细胞仪检测范围 第四十页，共五十七页，2022年，8月28日 第一页，共五十七页，2022年，8月28日 一、流式细胞术基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选技术. 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。 第二页，共五十七页，2022年，8月28日 第三页，共五十七页，2022年，8月28日 流式细胞仪构造图 第四页，共五十七页，2022年，8月28日 流式细胞仪五大系统 流动室与液流驱动系统 激光光源及光束成形系统 光学系统 信号检测与分析系统 细胞分选系统 第五页，共五十七页，2022年，8月28日 流动室与液流驱动系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流动室，430×180um,鞘液 1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样 第六页，共五十七页，2022年，8月28日 激光光源与光束成形系统 1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm 第七页，共五十七页，2022年，8月28日 光学系统 透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter SP：short-pass filter BP：band-pass filter 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 第八页，共五十七页，2022年，8月28日 信号检测与分析系统 物理参数 FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度 第九页，共五十七页，2022年，8月28日 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞、死细胞和碎片 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。 第十页，共五十七页，2022年，8月28日 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。 5% 32% 默认阈值 升高阈值后 第十