永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪.docx

永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪 永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪 一、引言 猪小肠是人和动物营养吸收的关键器官之一，其上皮细胞是吸收营养物质的主要细胞类型。因此，建立猪小肠上皮细胞系对于研究营养吸收、肠道病毒感染、营养调节、肠道微生物等方面的基础和应用研究具有重要意义。目前，已经建立了许多哺乳动物小肠上皮细胞系，如小鼠小肠上皮细胞系（IEC-6, Caco-2）、人小肠上皮细胞系（HT-29, Caco-2），但猪小肠上皮细胞的研究相对较少。因此，本文旨在建立永生化的猪小肠上皮细胞系，并对其进行初步的鉴定和应用。 二、实验材料和方法 1. 实验动物：8周龄的健康种猪，于实验开始前3天停止饮食，但仍供应清水。 2. 细胞分离和培养：将小肠切成小段，用PBS洗涤后去除黏膜和肌层，然后将小肠段切成小片，并加入1mg/ml胰酶和0.25mg/ml胆酸，37℃胶乳酶化60分钟，过筛收集细胞，离心并取出上清液，用DMEM/F12培养基补充10%FBS、1%青霉素和链霉素，将细胞悬液移至25cm2的培养瓶中培养。将培养液换液，定期检查细胞生长情况，当细胞密度达到80%时，重新分离细胞，剪切成细胞悬液，移至新的培养瓶中培养，直至细胞进入平稳生长期为止。 3. 细胞鉴定：应用光学显微镜观察细胞形态，用Immumofluorescent技术进行CK18、E-cadherin和β-catenin等上皮标志物的表达，采用RT-PCR进行细胞基因表达分析。 4. 细胞应用：应用建立的猪小肠上皮细胞系评估营养物质的吸收情况，同时考察肠道病毒感染、肠道微生物和营养调节对细胞的影响。 三、结果与分析 1. 细胞培养和鉴定： （1) 经过冷冻保存和传代，猪小肠上皮细胞系成功建立并永生化。细胞在培养瓶中呈现较好的长条形态，具有较高的增殖和生长能力。在经过4代传代后细胞数量达到稳定。 （2) 猪小肠上皮细胞系的上皮细胞标志物CK18、E-cadherin和β-catenin的免疫荧光结果显示，细胞具有上皮细胞的形态特征，表达上皮标志物的结构特点。 （3) 基因表达分析表明，猪小肠上皮细胞系具有肠上皮细胞的表达基础，包括Apn、S2和CCKAR等。 2. 细胞应用： （1）营养物质的吸收评估：将不同浓度的氨基酸、葡萄糖和脂肪酸等添加到培养基中，用建立的猪小肠上皮细胞系对不同浓度的营养物质进行吸收和转运实验。结果显示，猪小肠上皮细胞系对不同浓度的营养物质有不同程度的吸收和转运能力。 （2）肠道病毒感染：用PEDV病毒对建立的猪小肠上皮细胞系进行感染实验，病毒复制和细胞凋亡分析表明，PEDV病毒可以感染猪小肠上皮细胞系，导致细胞损伤和凋亡。 （3）营养调节：在建立的猪小肠上皮细胞系中加入维生素A、维生素D和短链脂肪酸等营养物质，采用MTT检测细胞的活性和增殖情况。结果表明，这些营养物质可以促进猪小肠上皮细胞的增殖。 四、结论 本研究成功建立了猪小肠上皮细胞系，并证实其为上皮细胞，具有一定的生长能力和吸收功能。此外，该细胞系还具有对疾病、营养和微生物等因素的应答性，可用于营养学和生物学等方面的研究和应用。