抗NcP40单抗制备及牛新孢子虫.docx

抗NcP40单抗制备及牛新孢子虫 一、抗NcP40单抗制备 1. 实验材料： （1）NcP40蛋白表达质粒 （2）E. coli BL-21(DE3)菌株 （3）亲和层析树脂：昆布仿生亲和层析树脂（海洋生物技术有限公司） （4）SDS凝胶：5%、10%、12%、15%和17.5%的聚丙烯酰胺凝胶 （5）Western blot试剂盒：ECL（Thermo Fisher Scientific）和HRP-标记的抗鼠IgG二抗（Santa Cruz Biotechnology） 2. 实验步骤： （1）构建表达NcP40蛋白的质粒 在质粒载体pET-28a中插入NcP40蛋白的基因序列，构建表达NcP40蛋白的质粒。 （2）表达NcP40蛋白 转化E. coli BL-21(DE3)菌株，进行表达NcP40蛋白。将感受态细胞在50 μg/mL的kanamycin培养基中生长，直至OD600达到0.6-1.0时，加入IPTG（最终浓度为1 mM）诱导表达，放到摇床上（高速摇动，37℃，12 h）。 （3）制备NcP40蛋白亲和柱 将200 mL的菌液离心，将沉淀加入10 mL质量经过检验的昆布仿生亲和层析树脂中。放入清洗的柱子中，用PBS缓冲液（pH=7.4）进行洗脱。洗脱物将被冻干并储存。 （4）鉴定NcP40蛋白 用SDS进行NcP40蛋白鉴定。将不同质量的蛋白样品（10 μg）分别加