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蛋白质表达的学习资料;;;蛋白质生物合成的基本原理;mRNA的生物合成 (转录);启动子是DNA分子可以与RNA取聚合酶特异结合的部位,也就是转录开始的部位。 某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。 以开始转录生成RNA 5’端 第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。 转录的起始点不是翻译起始点。;原核生物启动子 5’- TTGACG -- TATAA -- 起始位点-3’ -35区 -10区 +1（A、G） Pribnow框;-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动子-10和-35区之间的间隔为17±1 bp，增加或减少都能明显影响启动子强度。;在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的则相反。 外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。 带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。 解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。;转录终止信号即终止子，其作用是使RNA聚合酶在DNA模板的特异位点终止RNA的合成。;(DNA)3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5 (RNA)5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3‘ 通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。;茎环结构使转录终止的机理;;蛋白质的生物合成（翻译）;SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5`末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3— -11bp）。 SD序列与16s rRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。 mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG 16S rRNA3` -------AUUCCUCCA-------;大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性;DB 序列 5-AUGAAUCACAAAGUG-3‘ DB 序列（ downstream box ）位于起始密码下游，16S rRNA的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响mRNA的起始翻译。 真核生物无SD序列??但是有一个Kozak序列，这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。;遗传密码与tRNA;第19页/共84页;? N端fMet或Met的切除 ? 二硫键的形成 ? 特定氨基酸的修饰 ? 切除新生肽链中非功能片段 ? 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 ? 糖基化，磷酸化等等;不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的肽段---信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。;一些信号肽的一级结构;蛋白的分泌（一）;蛋白的分泌（二） ;蛋白的糖基化;革兰氏阳性菌蛋白的分泌;革兰氏阴性菌蛋白的分泌; 多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。;理想的表达载体质粒包括： 一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点 一个调节型的强启动子 一个选择性标记 一个复制起点 一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签 一个转录终止信号 一个分泌信号肽（分泌型）;第30页/共84页;融合蛋白;融合蛋白作为抗原的标记蛋白;MBP麦芽糖结合蛋白;原核生物表达系统;大肠杆菌表达体系的缺点 缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 表达产物不稳定，易被