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农学食品生物技术课程;第一章 蛋白质一级结构的测定;蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 ;1，样品必需纯（97%以上）； 2，已知蛋白质的分子量； 3，测定蛋白质由几个亚基组成； 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 ; 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质样品摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目。;酸水解;第7页/共127页;色氨酸分析－碱水解;羟基氨基酸的测定;(1)多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 ;①非共价键连接的破坏 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). ;②二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 ;(2)分析多肽链的N-末端和C-末端。;多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 ;Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 ;在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 ; 多肽或蛋白质的末端氨基酸与PITC作用生成苯氨基硫甲酰多肽或氨基酸（PTC-氨基酸）；在酸性有机溶剂中加热时，N-端PTC-氨基酸发生环化生成PTH-氨基酸从肽链上掉下来。 PTH-氨基酸用有机溶剂抽提干燥后，可用TLC、气相色谱、高效液相色谱等方法进行鉴定。 此原理也用在肽段的氨基酸顺序测定上。 ;氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。;此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 ;羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。;(3)多肽链的断裂和分离 可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 ;? 酶解法: 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶 ;Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。;减少trypsin的作用位点： 马来酸酐修饰Lys残基 1,2-环己二酮修饰Arg残基 增加trypsin的作用位点： 氮丙啶修饰Cys残基侧链成为类似Lys的侧链使trypsin能断裂Cys羧基侧的肽键;或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。;Pepsin：R1和R2＝疏水性氨基酸。R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 作用pH为2，二硫键在酸性条件下稳定，常用于二硫键位置的确定中。;② 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 ;(4)测定每个肽段的氨基酸顺序。;Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循