原生质体培养和体细胞杂交PPT课件.pptVIP

原生质体培养和体细胞杂交 当前您正浏览第一页，共四十页。 (1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑。 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 本章教学目的与要求 当前您正浏览第二页，共四十页。 原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 当前您正浏览第三页，共四十页。 微 丝 叶绿体 线粒体 质 膜 细胞核 内质网 微 管 细胞壁 高尔基体 植物细胞模式图 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 液 泡 当前您正浏览第四页，共四十页。 第一节、原生质体分离及纯化 一、原生质体分离 双子叶外植体 胚性细胞 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 当前您正浏览第五页，共四十页。 多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。 第一节、原生质体分离 及纯化 （一）材料来源 禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。 当前您正浏览第六页，共四十页。 第一节、原生质体分离 及纯化 （二） 分离方法 机械分离法 酶法分离法 当前您正浏览第七页，共四十页。 1、机械分离法（Machanical isolation） 第一节、原生质体分离 及纯化 优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大 当前您正浏览第八页，共四十页。 （1）酶的种类 纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶 2、酶法分离（Enzymatic isolation） 第一节、原生质体分离 及纯化 当前您正浏览第九页，共四十页。 （2）酶液的配制 第一节、原生质体分离 及纯化 渗透压稳定剂及pH 酶的配比及浓度 当前您正浏览第十页，共四十页。 （3）分离原生质体 第一节、原生质体分离 及纯化 两步分离法 一步分离法 方法有二： 叶肉原生质体分离提纯 当前您正浏览第十一页，共四十页。 图示原生质体分离过程（以叶片为例） 第一节、原生质体分离 及纯化 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 当前您正浏览第十二页，共四十页。 第一节、原生质体分离 及纯化 叶片 愈伤组织 当前您正浏览第十三页，共四十页。 二、 原生质体纯化与活力测定 （一）原生质体纯化 第一节、原生质体分离 及纯化 方法三种 离心沉淀法 漂浮法 界面法 当前您正浏览第十四页，共四十页。 1、 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 第一节、原生质体分离 及纯化 当前您正浏览第十五页，共四十页。 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：离心。 第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。 第一节、原生质体分离 及纯化 当前您正浏览第十六页，共四十页。 3 、 界面法 25%蔗糖溶液 13%甘露醇溶液 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。 第一节、原生质体分离 及纯化 当前您正浏览第十七页，共四十页。 （二） 原生质体活力测定 1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 第一节、原生质体分离 及纯化 当前您正浏览第十八页，共四十页。 第二节