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DNAExtraction法医学的课件资料第1页/共86页 DNA提取的原因DNA的分型需要DNA的直接参与反应过程DNA位于细胞内，细胞内可能含有抑制反应的蛋白或其他细胞成份DNA和蛋白质结合在一起不同的反应需要应用不同的DNA没有杂质纯DNA可使反应达到最佳法医学生物检材常含有抑制酶、PCR反应的物质第2页/共86页 DNA提取方法不同的检材用不同的方法不同的检材量可能使用不同方法和检材的细胞类型有关可根据肉眼、检查、显微镜下以及预试验来决定DNA的提取方法DNA提取的主要方法有机法（酚/氯仿法）Chelex法FTA纸法硅珠法、磁珠法碱裂解法第3页/共86页 DNA EXTRACTIONORGANICCHELEXFTA PAPEROTHERSNON-ORGANIC (6M NaCl)QUICK DIRTY (0.2M NaOH)QIAamp第4页/共86页 DNA提取的基本一般过程破膜：裂解细胞膜、核膜去圬剂：SDS，低渗破坏蛋白质PK、加热提纯DNA沉淀去除杂质吸附杂质第5页/共86页 第6页/共86页 有机法(organic extraction)经典的DNA抽提法先用SDS破膜，PK消化蛋白质，释放DNA用酚一氯仿萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中再用无水乙醇脱水，使DNA沉淀出来其提取的DNA分子结构完整，纯度较高，可抽提样本量大的DNA酚/氯仿法几乎适用所有种类生物检材的DNA提取，是DNA提取的基本方法。第7页/共86页 全血有机法过程溶血：抗凝全血+红细胞裂解液；离心，吸去上清，保留离心管的底部有白色白细胞沉淀。沉淀物中加入细胞核裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH8.2, 0.4mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA)，混匀加入SDS+蛋白酶K，摇匀。37℃孵育消化8小时以上。酚/氯仿法提取加入与溶液等体积的Tris-HCl饱和酚，轻摇，使酚和溶液混匀。摇晃太大力，可使DNA断裂。要有耐心。第8页/共86页 离心。离心管内的溶液分成两层，上层为含DNA的水相，下层为含有蛋白质的酚。将上层液体用吸管转移至另一个离心管内。注意不要触动分界面上积聚的变性蛋白。加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合物(酚:氯仿:异丙醇=25:24:1），混匀溶液，离心，离心管内的溶液分成两层，上层为含DNA的水相。将上层液体用吸管转移至另一个离心管内。加入等体积的氯仿/异丙醇混合物(氯仿:异丙醇=24:1），混匀溶液，将上层液体用吸管转移至另一个离心管内。加入2~3倍体积的冷100％乙醇（-20℃），轻轻来回倒置摇匀，即见白色絮状的DNA析出。第9页/共86页 DNA可用火焰灭菌的玻璃钩针钩出，70％冷乙醇淋洗二次，室温干燥。干燥DNA的插入装有1×TE的Eppendorf管中，使DNA逐渐溶解从钩针上溶解下来。或者高速离心，使DNA沉淀下来，去掉液体。再用70％冷乙醇洗2次，以去除盐离子。室温干燥后，加入适量的1×TE或水溶解DNA。溶解DNA时最好是要过夜，因为过于干燥的DNA较难溶。提取的DNA在-20℃可保存数年。第10页/共86页 酚/氯仿法中各种试剂主要作用 蛋白质分子表面带有亲水性基团，易通过水合作用进入水溶液中。酚的极性较低，氯仿是非极性分子，水是极性分子。酚或氯仿可以挤走蛋白质水溶液中的水分子，蛋白质失去水合作用而变性沉淀出来。酚或氯仿与水溶液的混合物离心后，由于比重的不同，酚/氯仿位于试管下层(有机相)，水相位于上层。变性的蛋白质则聚集在两者的界面。DNA具有亲水性，仍保留在水相中。第11页/共86页 酚的变性作用很强，但与水有一定的互溶，这部水溶液中的DNA就会丢失。氯仿的变性作用不如酚，但与水不互溶，不会带走DNA。所以抽提过程中酚与氯仿混合使用。氯仿还有助于水相与有机相分离。氯仿与酚是互溶的，酚/氯抽提后，单独用氯仿再抽取一次，以去除残留的酚。否则酚对后面的反应有抑制作用。酚是酸性的，DNA可溶于酸性有机溶剂，因此，酚在使用前必须用0.5M Tris--HCl(pH8.0)饱和，使其pH值在7.8以上。酚的饱和过程又叫做酚的平衡，经过饱和pH值在7.8以上的酚称为饱和酚或平衡酚。pH8时，DNA更易进入水相中，并防止酸性酚溶解DNA。第12页/共86页 经饱和的酚常加入0.01% (w/v)8-羟基喹啉固体粉末（8-hydroxyquinoline)，此时的饱和酚为淡黄色。这种酚可以在4℃保存一段时间。之后淡黄色消失或呈粉红色，说明酚已被氧化，不能再使用。8-羟基喹啉不仅具有抗氧化作用，而且是一种指示剂。8-羟基喹啉还是弱的金属离子螯合剂，有抑制RNase的作用。异戊醇的作用是降低分子的表面张力，减少混合过程中泡沫的发生，使有机相和水相充分作用。并使有机相、变性