DNA测序技术的原理发展及在医学中的应用.pptxVIP

DNA测序技术的原理发展及在医学中的应用第1页/共48页 DNA测序技术DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸(dATP dTTP dCTP dGTP)。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。第2页/共48页 DNA测序技术测定未知序列 研究基因组多样性 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定第3页/共48页 DNA测序的发展历程经典DNA测序技术 70年代末，Maxam和Gilbert发明化学法、Sanger发明双脱氧终止法手动测序（同位素标记） 80年代中期，出现自动测序仪（应用Sanger双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，采用计算机图象识别 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳 2001年完成人类基因组框架图，全部采用基于Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。 第4页/共48页 DNA测序的发展历程第5页/共48页 DNA测序的发展历程第二代测序技术第6页/共48页 DNA测序的发展历程454 的特点与主要应用读长较长，400－600bp通量较低，400－600Mb相对成本较高主要应用：de novo测序第7页/共48页 DNA测序的发展历程Solexa 的特点与主要应用读长较短，100－150bp通量高主要应用：RNA测序、表观遗传学研究第8页/共48页 DNA测序的发展历程SOLiD 的特点与主要应用读长较短，50-75bp精度高，通量高， 主要应用：基因组重测序、SNP检测等第9页/共48页 DNA测序的发展历程三种第二代测序技术对比第10页/共48页 DNA测序的发展历程第三代测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。 第11页/共48页 DNA测序的发展历程第三代测序技术 第12页/共48页 双脱氧链末端合成终止法1977年，英国人Frederick Sanger 创建了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 双脱氧链末端合成终止法第13页/共48页 双脱氧链末端合成终止法第14页/共48页 双脱氧链末端合成终止法第15页/共48页 双脱氧链末端合成终止法基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。第16页/共48页 双脱氧链末端合成终止法测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。具体操作第17页/共48页 双脱氧链末端合成终止法第18页/共48页 双脱氧链末端合成终止法引物?在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。?通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。?如果是PCR产物直接测序，也可以用一端的PCR引物第19页/共48页 双脱氧链末端合成终止法测序酶（sequenase）测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。该酶活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。第20页/共48页 双脱氧链末端合成终止法测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。最早采用放射性标记引物，后来采用荧光剂标记。第21页/共4