特异性微小RNAa抑制剂对胃癌细胞增殖影响系列.pptxVIP

特异性微小RNAa抑制剂对胃癌细胞增殖影响系列第1页/共25页 一、立 项 依 据第2页/共25页 (一)胃癌概述1.胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。2.全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位.3.早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。4.胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移5.肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物第3页/共25页 (二)微小RNA1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。2.微小RNA分子(micro RNA, miRNA)是非编码的RNA分子(noncoding RNA, ncRNA), 对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用, 研究miRNA的表达, 尤其对其功能研究, 对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。第4页/共25页 (三)胃癌组织中微小RNA的表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNAGuo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4): 652-657 19种差异表达的微小RNA 12 ? 7 ?miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达 第5页/共25页 二、研究目标第6页/共25页 microRNA-19a胃癌细胞→ microRNA-19a ? ?？microRNA-19a抑制剂第7页/共25页 本课题主要研究特异性微小RNA-19a的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。初步假设：特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。第8页/共25页 三、研究内容第9页/共25页 设计并合成微小RNA-19a的2’-甲氧修饰的RNA寡核苷酸（微小RNA抑制剂），用脂质体转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞，然后用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术检测微小RNA-19a的表达情况，最后用MTT法检测胃癌细胞的增殖情况。第10页/共25页 四、可行性分析第11页/共25页 微小RNA的抑制剂由生物公司合成并购买细胞转染实验以及MTT法技术都已普及实时定量-PCR基础二楼生化教研室可进行本实验第12页/共25页 五、研究方案设计第13页/共25页 材料胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）DMEM培养液（4°C保存）胎牛血清RNA提取Trizol法试剂转染Lipofectamine 2000试剂实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒通用逆转录引物针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2’-甲氧修饰的RNA寡核苷酸第14页/共25页 第15页/共25页 方法1、细胞培养 胃癌SGC-7901和MGC-803细胞在37度、含5%CO2的培养箱中培养。DMEM培养液中含有10%小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。2、细胞转染 转染前1d , 选择生长状态良好的细胞胃癌细胞，以3×105cells/well的密度接种6孔板，待细胞密度达到50%-70%后，用lipofectamine 2000转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养4小时后新鲜培养液。3、细胞总RNA提取及实时定量RT-PCR检测微小RNA的表达水平 用Trizol试剂提取细胞内总RNA并测定RNA浓度，逆转录成cDNA，再按说明书进行实时定量PCR，以U6作为小RNA含量的参照。PCR反应条件为：先95度15min热启动，然后按94度15s、60度30s、72度30s，共40个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小RNA的相对表达量用 方法来表示，第16页/共25页 4、MTT法检测胃癌细胞增殖情况 以1.5 ×104cells/well接种胃癌细胞于96孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小RNA抑制剂阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长差异，在确定前2组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用3个不同浓度（0.50μmol/L\0.7μmol/L\1.00μmol/L）的微小RNA抑制剂转染细胞，每组设3个复孔。4