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ch动物组织培养; 第一节、动物组织培养的基础;第3页/共77页;二、 动物细胞培养定义;动、植物细胞培养与微生物培养区别;Classification of Cell Cultures;Primary Culture;三个相关定义;第9页/共77页;第10页/共77页;3、生长特性;粘附生长;两种贴壁的培养细胞;Contact inhibition;B 悬浮型;第二节、常用的细胞培养方法;二、动物细胞培养的特殊性;Rich Media Are Required for Culture of Animal Cells;Medium;Medium;Medium;Medium; Pg, Oxygen tension provided by the incubator Pc, Oxygen tension at the bottom of the dish Diffusion based on Fick’s law D*K*(Pg-Pc)/d where D: diffusivity of O2 in water at 37?C uptake rate = diffusion rate;Medium;Medium;Medium;Solutions used in cell culture;Trypsin EDTA (TRED)An enzyme used to detach the cells from a culture dish.Trypsin cleaves peptide bonds (LYS or ARG) in fibronectin of the extracellular matrix.More about fibronectin and the ECM next weekEDTA chelates calcium ions in the media that would normally inhibit trypsin.;Trypsin will self digest and become ineffective if left in water bath more than 20 minutes.Trypsinizing cells too long will reduce cell viability;Trypan BlueAn exclusion dyeLiving cells cannot take up the dye and will appear bright and refractile.Dead cells with broken membranes will absorb the dye and appear blue.Usually add 200 ml of trypan blue to 200 ml of cell suspension in eppendorf tube;四、常用的培养方法;第32页/共77页;单玻片的再培养;（2）培养瓶培养法将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。凡是可以用于培养生物结构的瓶子都可称为培养瓶。 ;;（3）旋转管培养法将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。 ;（4）灌注小室培养法将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。 最初是1912年由Burrows尝试设计了一种简单的灌注小室培养模型。 ;（5）培养板培养法具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用???培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。 ;第三节、培养细胞的生长与保存;（二）传代期 原代培养细胞一经传代后便该称为细胞株，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。 ;（三）衰退期 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。 ;;Kinetics of Growth;二、原代培养与传代培养技术 ;机械分散组织细胞方法;消化初代培养法基本步骤;组织块初代培养法;一般传代培养的步骤 ;消化法传代培养步骤;三、Cryopreservation;要点用慢冻快融的方法：标准的冷冻速度为－1－－2度/分，当温度达－25度时，下降率可增至－5度至－10度/分，到－100度时，则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快会影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成，但各种细胞对冻结速度要求也