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基因工程育种微生物遗传育种第1页/共67页 2奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割 Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆 Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与λ噬菌体基因融合，成功构建重组DNA； Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。DNA的快速测序 Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术 1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger第2页/共67页 3分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物基因工程操作的主要步骤第3页/共67页 4第一节 基因克隆的酶学基础一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：exonuclease核酸内切酶：endonuclease第4页/共67页 51、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破坏外源DNA，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进 行切割（2）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的DNA，使之不受限制机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到 限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。第5页/共67页 62、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修饰限制限制、修饰蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基所需辅助因子ATP, Mg2+, SAMMg2+ATP, Mg2+, SAM识别序列EcoB: TGA(N)8TGCT4~8bp,旋转对称EcoPI: AGACC切割位点距识别位点至少1000kb处随机切割在识别序列内（或附近）距识别位点3’-端24~26bp处第6页/共67页 73、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一个字母]＋编号（罗马数字） [例]EcoRI, EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得 第7页/共67页 84、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure )例：AluI：5’-AGCT-3’ AsuI：5’-GGNCC-3’ PstI： 5’-CTGCAG-3’第8页/共67页 9（2） 切割：产生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’产生3’-OH单链粘性末端: PstI5’-C TGCA ↓ G -3’3’-G ↑ ACGT C-5’ 产生5’-P单链粘性末端: EcoRI5’-G↓AATT C -3’3’-C TTAA ↑G-5’ 第9页/共67页 10第10页/共67页 11酶剪切条件需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。第11页/共67页 12狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。 HpaⅡ与MspI: CCGG广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端。 （3）同裂酶 ( isoschizomers )第12页/共67页 13 两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: G↓GATCC BglⅡ：T↓ GATCA（4） 同尾酶 ( isoocaudamer )第13页/共67页 14二、DNA连接酶（DNA ligase ） 催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键。1、体外DNA连接连接具有互补粘性末端的DNA片段连接具有平末端的DNA片段先在D